朱中书　孙钦然　张丽瑾　王玉洁　刘方铭　刘维菊　尹　聪　吴文庆

(山东省临沂市中医医院针灸推拿科，山东　临沂　276002)



针刀治疗动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型的研究※

朱中书孙钦然1张丽瑾2王玉洁2刘方铭△刘维菊1尹聪1吴文庆1

(山东省临沂市中医医院针灸推拿科，山东临沂276002)

目的通过完全切断颈后伸肌群的方法，建立针刀治疗的动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型，为针刀治疗颈椎病提供一种较可靠的实验模型。方法将36只SD大鼠随机分为模型组(18只)、对照组(18只)，每组又分1个月、3个月、5个月组，每组6只，模型组采用手术方法完全切断颈后伸肌群，对照组行伪手术。造模术后于相应时间点进行组织形态学观察，并进行免疫组化和定量多聚链反应(PCR)检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达强度及基因表达变化。结果组织形态学观察：颈椎间盘退变程度逐渐加快、加重，模型组颈椎间盘退变较对照组明显；3个月时模型组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白检测：(1)免疫组化染色法，Ⅰ型胶原与椎间盘退变呈正相关性，Ⅱ型胶原与椎间盘退变呈负相关性，二者在椎间盘退变过程中发生转换。模型组Ⅰ、Ⅱ型胶原表达均在3个月时较对照组明显(P<0.05)，而对照组Ⅰ、Ⅱ型胶原表达5个月较1个月时才开始明显(P<0.05)。(2)PCR检测：随着椎间盘退变进程，Ⅰ型胶原基因表达逐渐增加；Ⅱ型胶原基因表达逐渐减少。模型组Ⅰ、Ⅱ型胶原基因表达均在3个月时较对照组有明显变化(P<0.05)。结论完全切断颈后伸肌群可造成大鼠颈椎动静力失衡，从而加快颈椎间盘退变进程，3个月时即退变明显，为针刀治疗颈椎病的机制研究提供一种理想的动物模型。

疾病模型,动物；脊柱骨赘病；颈椎；大鼠；动物

颈椎病(cervical spondylosis，CS)是由于颈椎间盘退变本身及其继发性改变刺激或压迫邻近组织，并引起各种症状和(或)体征的病症[1]。颈椎病是临床常见病、多发病，给患者带来巨大痛苦和不便的同时，严重影响着其身心健康和生活质量。随着人口老龄化的加剧和社会工种、生活方式的转变，颈椎病的发病率逐年上升，呈普遍化、年轻化趋势，患病率在某些职业中甚至高达90%以上[2]。颈椎病以颈椎间盘退变为内在病理基础，颈椎间盘退变是颈椎病发生的始动环节和根本原因[3-4]。目前认为防止或延缓颈椎间盘退变的发生有助于从根本上防止颈椎病，但由于缺乏合适的动物模型，椎间盘退变和颈椎病发生的确切原因及机制尚不十分清楚。运用针刀松解调节颈部动静力失衡治疗颈椎病疗效可靠[5-6]，但针刀治疗颈椎病的机制研究相对薄弱。本研究基于针刀医学原理建立一种大鼠颈椎间盘退变模型，进而为针刀治疗延缓颈椎间盘退变机制的研究提供实验载体，并为颈椎病的预防及早期干预提供实验依据。

1　材料与方法

1.1动物及分组3个月龄SPF级SD健康雌性大鼠36只，体质量(240±10)g，由山东鲁抗医药股份有限公司质检中心实验动物室提供(许可证号：SCXK鲁20130001)，室内空气流通，相对湿度60%±10%，温度(23±2)℃，以国家标准固体混合饲料喂养，自由饮食。实验过程对动物处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[7]。按随机数字表法分为模型组、对照组各18只，每组再按照造模后1个月、3个月、5个月分组，每组6只。

1.2主要试剂及实验器材生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒以及浓缩型二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Anti-Collagen Type Ⅰ、Rat Type Ⅱ CollagenⅠ、Ⅱ型胶原蛋白大鼠抗体(美国 MerckMillipore 公司)，苏木素-伊红(HE)(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，总核糖核酸(RNA)提取试剂盒以及两步法MMLV RT-PCR扩增试剂盒(北京达科为生物技术有限公司)，SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus，RR820A，TaKaRa)，脱氧核糖核酸(DNA)引物及内参(上海生工生物工程股份有限公司)，石蜡切片机(德国SLEE)，生物组织摊烤片机(武汉中天鸿博医疗设备有限公司)，GenePro基因扩增仪(BIOER，C-E)，台式低温离心机(Thermo Scientific Heraeus Multiftige X1R)，-80 ℃超低温冰箱(Thermo，FORMA700 SERIES)，组织匀浆机(ULTRA TURRAX IKA T18 basic)，光学显微镜(日本OLYMPUS)，照相显微镜(日本OLYMPUS FSX 100)，研究级正置式荧光显微镜(德国卡尔·蔡司 Axio Imager.A2)，Image-Pro Plus 6.0软件(美国 Media Cbernetics 公司)。

1.3动物模型建立模型组参照上海中医药大学脊柱病研究所的造模方法[8]，改进建立动静力失衡性颈椎病模型。大鼠适应性喂养1周，采用10%水合氯醛腹腔内注射麻醉，按300 mg/kg用药，麻醉成功后，大鼠两耳至两肩胛间范围内备皮，将大鼠俯卧位固定于固定板上，碘伏消毒，敷洞巾，取颈后部正中切口，从寰枕关节至第2胸椎棘突之间纵向切开皮肤及皮下组织2～2.5 cm，充分钝性游离颈部各肌肉层至暴露颈椎，由里向外逐层依次完全切断第2～7颈椎棘间韧带和棘上韧带，深层的颈夹肌、头颈寰最长肌、颈髂肋肌和头半棘肌，浅层的颈阔肌、颈斜方肌、头颈菱形肌，止血后间断缝合两侧骶棘肌和皮肤，术后连续3 d注射青霉素以防感染，术后不拆线，让线自然脱落。对照组行伪手术，仅切开颈后部皮肤后缝合。造模术后大鼠予以自由摄食、饮水。

1.4标本采集与指标检测分别于造模后相应时间点采集标本。以急性失血法处死大鼠，即取第2～7颈椎段椎体，磷酸缓冲液(PBS)冲洗血污等，定位剖取第4～5颈椎、第5～6颈椎带椎体间盘，用10%甲醛固定，乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙处理2周后石蜡包埋切片，常规苏木精-伊红(HE)染色及免疫组化对Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白进行检测(以PBS代替一抗作阴性对照)，光学显微镜下对椎间盘进行组织形态学观察，按Miyamoto等[9]分级标准将椎间盘评分(见表1)。另剖取第2～3颈椎、第3～4颈椎、第6～7颈椎无椎体间盘，-80 ℃保存，待标本采集完全后行定量多聚酶链反应检测(PCR)(引物序列及内参见表2)，对各组Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白基因表达变化进行检测。免疫组化及PCR步骤均严格按照试剂盒说明进行操作。

表1　Miyamoto椎间盘形态学分级评分标准

表2　引物序列表

2　结　果

2.12组大鼠椎间盘光镜下组织形态学观察。

2.1.12组大鼠颈椎间盘退变程度Miyamoto分级评分比较见表3。

表3　2组大鼠颈椎间盘退变程度Miyamoto分级评分比较　分，

与同期对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组1个月比较，△P<0.05，△△P<0.01；与对照组1个月比较，#P<0.05

由表3可见，颈椎间盘退变程度逐渐加快、加重，模型组颈椎间盘退变较对照组明显(P<0.05，P<0.01)；3个月时模型组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.1.22组大鼠颈椎间盘组织形态学观察

2.1.2.1对照组大鼠颈椎间盘组织形态学变化见图1。

图1　对照组颈椎间盘组织形态学变化(HE染色，×40　标尺示：150 μm)

由图1可见，对照组A(1个月)，椎间盘形态规则，髓核居中，纤维环排列整齐，软骨终板清晰；对照组B(3个月)，较1个月髓核略后移，余变化不大；对照组C(5个月)，椎间盘形态较规则，髓核皱缩，纤维环排列较整齐，软骨终板边缘不整。

2.1.2.2模型组大鼠颈椎间盘组织形态学变化见图2。

由图2可见，模型组A(1个月)，椎间盘形态规则，髓核居中，纤维环排列整齐，软骨终板清晰，形态及结构基本正常；模型组B(3个月)，椎间盘形态较规则，髓核皱缩，纤维环排列略紊乱，软骨终板较清晰；模型组C(5个月)，椎间盘形态改变，髓核皱缩明显，纤维环排列紊乱，软骨终板边缘缺损、毛糙。

图2　模型组颈椎间盘组织形态学变化(HE染色，×40　标尺示：150 μm)

2.2Ⅰ、Ⅱ型胶原检测

2.2.1免疫组织化学染色法检测Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达显微镜下观察，以细胞外基质见棕黄色阳染颗粒和(或)区判定为阳性表达，采集图片(如图3)。利用Image-Pro Plus软件，以其各自的平均光密度值反映Ⅰ、Ⅱ型胶原染色强度变化，客观评价Ⅰ、Ⅱ型胶原表达强度。结果显示，Ⅰ型胶原与椎间盘退变呈正相关性，Ⅱ型胶原与椎间盘退变呈负相关性，二者在椎间盘退变过程中发生转换。

图3　Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达

2.2.2定量多聚酶链反应(PCR)检测Ⅰ、Ⅱ型胶原基因水平表达见表4。

表4　各组大鼠Ⅰ、Ⅱ型胶原检测　±s

与同期对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组1个月比较，△P<0.05，△△P<0.01；与对照组1个月比较，#P<0.01

由表4可见，随着椎间盘退变进程，Ⅰ型胶原基因表达逐渐增加；Ⅱ型胶原基因表达逐渐减少。模型组Ⅰ、Ⅱ型胶原基因表达均在3个月时较对照组明显变化(P<0.05)。①Ⅰ型胶原基因表达：模型组与对照组比较，3个月、5个月均有统计学意义(均P<0.05)；模型组组内与1个月比较，3个月、5个月均有统计学意义(均P<0.05)。②Ⅱ型胶原基因表达：模型组与对照组比较，3个月、5个月均有统计学意义(均P<0.05)；模型组组内与1个月比较，3个月、5个月均有统计学意义(均P<0.05)。

3　讨　论

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)的起因及发生机制尚未完全明确，目前认为退变过程中椎间盘变化主要包括生物力学失衡和生物化学失衡两方面。

椎间盘在机械应力分布的改变下的相应变形是脊柱运动和功能实现的前提。颈椎间盘退变容易发生与颈椎承托头部重力并完成其各方向活动，兼具静态支撑和可运动功能，灵活性大、活动频率高。椎间盘退变是一种应力适应，颈椎长时间处于异常应力环境是导致退变的一个重要因素。在颈椎间盘渐进性退变过程中，软骨内形成骨赘，髓核由胶冻样组织变成纤维软骨组织，体积缩小，纤维环的层状结构紊乱，髓核和纤维环界限不清，椎间盘出现裂隙。因此，骨赘形成、纤维环裂伤、软骨终板钙化、schmorl结节形成及椎间隙狭窄是椎间盘退变的组织形态学标志[10]。而椎间盘的营养主要依靠软骨终板和纤维环的渗透作用，异常应力下的纤维环撕裂及软骨终板钙化必然影响髓核的营养供给，从而导致和(或)加速退变。本实验研究结果显示，随着退变的进程，椎间盘结构发生改变，逐渐出现纤维环紊乱、髓核皱缩、软骨终板钙化等改变，模型组颈椎间盘退变较对照组为快、为重，3个月时椎间盘退变即表现明显。

细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成与降解失衡使基质成分紊乱，导致相关椎间盘疾病的产生[11]。近年来研究主要集中在细胞外基质，并认为细胞外基质的变化是最终导致椎间盘退变的关键[12]。正常椎间盘中细胞外基质处于合成和分解的动态平衡之中，而这种平衡在退变椎间盘中被打破[13]。胶原是重要的细胞外基质，不同类型的胶原在椎间盘组织中的结构、含量和分布，决定着椎间盘的生理特征及功能状态，胶原的变化与椎间盘的退变存在着密切关系。正常椎间盘中主要以Ⅰ、Ⅱ型胶原为主，约占椎间盘胶原的80%左右，其中髓核主要以Ⅱ型胶原为主，纤维环主要以Ⅰ、Ⅱ型胶原为主，软骨终板主要以Ⅱ型胶原为主，髓核吸收震荡、承受和传导压力、维持应力平衡的作用与椎间盘内存在大量的Ⅱ型胶原密切相关。随着椎间盘的退变，胶原类型发生转换，组织中Ⅱ型胶原的含量逐渐减少，Ⅰ型胶原含量逐渐增加，同时出现髓核含水能力降低，蛋白多糖含量下降等改变[14-15]。本实验研究结果显示，椎间盘退变过程中，Ⅰ型胶原含量及基因表达逐渐增加，呈正相关性，Ⅱ型胶原含量及基因表达逐渐减少，呈负相关性，二者在椎间盘退变过程中发生转换。模型组在退变过程中Ⅰ、Ⅱ型胶原变化较对照组明显，3个月时椎间盘内Ⅰ、Ⅱ型胶原变化已较为显著。

现代生物力学理论认为，正常颈椎的稳定性由包括椎体、附件、椎间盘和相连的韧带结构的静力平衡和颈部肌肉的动力平衡共同维系。颈椎椎体及椎间盘没有主动力学行为，后关节决定运动的形式，颈肌是运动的动力，维持着颈椎的动静态平衡，且在颈椎病的发展和临床治疗的每一个阶段、每一个环节均发挥着重要的作用[16]。大量研究证实，颈椎病的发生发展与颈椎相关肌肉系统病变密切相关[17]。颈椎病初发症状多为肌性症状。王拥军[18]认为颈椎生物力学失衡是颈椎间盘退变的主要机制，提出“动力失衡为先，静力失衡为主”的颈椎病病机学说。

一个适合、可靠的退变模型能为颈椎病发病机制的研究提供良好的实验载体，同时也是验证一种治疗方法有效性的有力保证，是问题研究的关键。目前，椎间盘退变模型较多，除沙鼠等极少数自然退变模型外，其他模型的建立均需实验操作诱导而产生。椎间盘退变模型必须具备以下条件：①能够最真实模拟人椎间盘退变过程；②具备较高重复性和可靠性。关于造模的物种选择仍存在较大争议，限于模型的易获得性及实验的可操作性、重复性高等因素，大鼠和兔仍是常用的模型实验动物。动静力失衡性颈椎退变模型通过损伤颈背部肌肉以及相关韧带，造成颈椎的动静力失稳，能够很好地模拟临床上颈背肌肉软组织由于长期反复持久的劳损与刺激而导致的颈椎退行性变，是一种“自发性”退变模型，越来越受到重视。近年来，以动静力失衡大鼠模型研究颈椎间盘退变的越来越多，但其模型的制备为切除颈后伸肌群诱导椎间盘退变[8，19-22]。

针刀治疗颈椎病有其独到的理论体系，针刀医学认为颈椎病的发生，主要是由于颈椎生物力学发生改变，导致动态平衡失调所致。急、慢性损伤后颈周软组织之间形成粘连、瘢痕、挛缩等病理改变是导致颈椎动静力失衡、引发颈椎病的主要原因。针刀通过切割和剥离达到调筋理筋的作用，恢复局部肌肉软组织的动态平衡，从而治愈颈椎病，体现了中医“骨病治筋”的理念。针刀松解是以调节局部相关易受损的肌肉起止点为治疗基础，多“以痛为腧”和“以筋结为腧”，“针至病所”是疗效前提。通过切除颈后伸肌群诱导椎间盘退变模型，针刀就失去了调节颈椎动态平衡的治疗点。

本实验通过完全切断颈后伸肌群、改变椎间盘应力诱导建立的动静力失衡大鼠模型，未破坏椎间盘完整结构，创伤性小、成功率和可重复性高，造模3个月时颈椎间盘即有明显退变表现，是针刀治疗颈椎病的机制研究的一种理想动物模型。同时，该模型体现了颈部肌肉损伤修复过程中产生的粘连、瘢痕、挛缩等病理因素在颈椎间盘退变中的重要影响，为颈椎病的针刀早期介入治疗和预防提供了理论依据。

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(本文编辑：董军杰)

Study of Needle-knife on degenerated cervical intervertebral disc in imbalance of dynamic and static forces rats

ZHUZhongshu*,SUNQinran,ZHANGLijin,etal.

*DepartmentofAcupunctureandMoxibustion,LinyiHospitalofTraditionalChineseMedicineinShandongProvince,Shandong,Linyi276002

ObjectiveTo establish models of degenerated cervical intervertebral disc in imbalance of dynamic and static forces rats which by means of cut off posterior neck extensors, that provide a stable experimental animal model of Needle-knife on the treatment of cervical spondylopathy. Methods 36 SD rats were randomly divided into model group (n=18) and control group (n=18). Then, rats in each group were sub-divided into one-month group, 3 months group and 5 months group, 6 rats in each group. The posterior neck extensors of model group were shut off, and the control group received sham operation. After modeling, the histomorphology at each point in time were observed, and the expressions of immunology and histology chemistry (IHC) and PCR of collagen typeⅠand Ⅱ were detected. Results Intervertebral disc degeneration grade was speed up and more serious, the changes in model group were more obviously, and there were statistical differences on intervertebral disc degeneration grade after three months between two groups (P<0.05). The IHC of collagen typeⅠand Ⅱ: The collagen typeⅠwas positively correlated with degenerated cervical intervertebral disc, and the collagen type Ⅱ was negative correlation, the transformation of collagen typeⅠand Ⅱoccurs during the changes of intervertebral disc degeneration. The expressions of collagen typeⅠand Ⅱafter three months in model group were obviously than those in control group (P<0.05). The collagen typeⅠand Ⅱ were strongly expressed after five months in control group than those at one month (P<0.05). The PCR detections: The expressions of typeⅠcollagen gene was positively related with the process of intervertebral disc degeneration, and the type Ⅱcollagen gene was negative. The expressions of type Ⅰand Ⅱ collagen gene in treatment group had obviously changes after three months as compared with those in control group (P<0.05). Conclusion Shut off the posterior neck extensors can lead to imbalance of dynamic and static forces in rats, which can accelerate the process of intervertebral disc degeneration. The obvious degeneration will turn up three months after operation, which provide an ideal animal model for study the mechanism of Needle-knife on cervical spondylopathy.

Disease model; Animal; Vertebra osteophytosis; Cervical vertebra; Rats

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.07.020

△山东省千佛山医院康复医学科，山东济南250014

朱中书(1986—)，男，住院医师，硕士。 研究方向：脊柱区带病的临床治疗和脊柱生物力学研究。

R-332；R681.550.23；R682.120.23

A

1002-2619(2016)07-1034-06

2015-09-08)

※ 项目来源：山东省自然科学基金(编号：ZR2010HM121)

1山东省千佛山医院康复医学科，山东济南250014

2山东中医药大学针灸推拿学院，山东济南250012