秦彩朋，刘春雷，赵燕辉，殷华奇，杜依青，胡风战，盛正祚，徐　涛△

(1. 北京大学人民医院泌尿外科， 北京　100044； 2. 北京大学国际医院泌尿外科， 北京　102206； 3. 青岛市中心医院泌尿外科， 山东青岛　266042)



·论著·

MEK/ERK通路蛋白在肾癌骨转移患者的表达

秦彩朋1,2，刘春雷3，赵燕辉3，殷华奇1，杜依青1，胡风战1，盛正祚1，徐涛1△

(1. 北京大学人民医院泌尿外科， 北京100044； 2. 北京大学国际医院泌尿外科， 北京102206； 3. 青岛市中心医院泌尿外科， 山东青岛266042)

目的：探讨MEK/ERK通路蛋白在肾癌骨转移患者原发灶及转移灶表达的差异及其意义，并探索这种差异的发生机制。方法： 选择北京大学人民医院2009年1月至2010年1月 7例肾癌骨转移患者的原发灶及转移灶组织标本，应用免疫组织化学法分析VEGFR-2、MEK、ERK蛋白在原发灶与转移灶表达的差异，VEGFR-2、MEK、ERK的Ⅰ抗工作浓度(体积比)分别为1 ∶200、1 ∶25、1 ∶250，应用PCR技术检测PDGFRA基因20号外显子，K-ras基因2号外显子，Braf基因15号外显子和MEK1基因2号外显子的相关突变。结果：免疫组织化学结果判读：细胞阳性率≤ 5% 为1分, 6% ～50% 为2分, 51% ～ 100% 为3分; 染色强度: 不着色为1分, 淡黄色细颗粒状为2分, 黄色颗粒状为3分, 棕黄色粗颗粒状为4分，将两个得分数相乘得到其表达强度。本组7例肾癌骨转移患者VEGFR-2在原发灶(2.86±2.27)和骨转移灶(2.67±1.85)表达差异无统计学意义(P=0.901)，而MEK(1.33±0.51vs. 6.10±4.10,P=0.015)和ERK(4.43±2.84vs.9.10±2.24,P=0.021)表达差异有统计学意义；在原发灶及转移灶标本中并未检测到相关的基因突变。结论：MEK/ERK通路蛋白在肾癌骨转移患者原发灶和转移灶表达的差异可能与其转移过程有关，也可能是影响靶向治疗效果的原因之一。

癌，肾细胞；MAP激酶信号系统；肿瘤转移；骨；突变

肾癌(renal cell carcinoma, RCC)占成人恶性肿瘤的2%～3%，高发年龄是60～70岁，男、女发病比例约为2 ∶1，且发病率约以每年2%的速度递增，肾癌患者转移的发生是肿瘤相关死亡的主要原因，约有1/3患者在确诊时已发生转移，此外，还有1/3患者在根治术后发生转移[1]，转移患者的平均生存期为7～11个月，5年死亡率大于90%[2]，加之肾癌对放疗和化疗不敏感，使得转移性肾癌患者的治疗显得尤为棘手和迫切，也正因为如此，靶向治疗成为转移性肾癌重要的治疗手段。目前肾癌的靶向治疗主要集中于多激酶抑制剂和mTOR抑制剂，距索拉菲尼、舒尼替尼以及替西罗莫司被批准应用于转移性肾癌的治疗已将近10年，虽然此后同类药物如帕唑帕尼、阿西替尼和依维莫司被研发并批准应用于转移性肾癌的治疗，但疗效并无明显提升，因此，至今舒尼替尼仍是治疗转移性肾癌的一线药物。多激酶抑制剂不仅至少抑制一种VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor)受体，同时抑制数十种其他位点，近期研究结果显示,抑制VEGFR以外的位点并不能提高转移性肾癌的治疗效果。目前，mTOR通路新抑制剂的尝试尚未取得突破，一个小样本Ⅱ期临床试验结果显示,一种非选择性PI3K和TORC1/2双重抑制剂apitolisib (GDC0980)针对抗VEGF治疗耐药的患者治疗效果同依维莫司相比，患者的无进展生存期反而缩短。GOLDⅢ期临床试验显示VEGFR和FGFR(fibroblast growth factor receptor)抑制剂多韦替尼在治疗一、二线靶向治疗失败的患者中效果并不优于索拉菲尼，此临床试验并没有获得其预期的治疗效果。一个尚无依据的假设提出多韦替尼的治疗效果可能仅来自对VEGFR的抑制，对FGFR的抑制并不能提高疗效，另外一种提高转移性肾癌疗效的思路,即靶向药物联合应用并未见取得成功的报道，药物的联合应用使得不良反应增加且并未取得更多的临床获益。一项包含168例转移性肾癌患者的研究报道,靶向治疗罕能使原发灶体积缩小，进一步提示转移灶同原发灶药物靶点可能存在差异[3]。Karashima等[4]的研究表明血管生成相关基因在转移灶中表达增高，而且体外细胞试验进一步证实转移癌细胞针对靶向治疗的耐药性增加，这种转移灶同原发灶对药物反应的差异性提示二者之间不同的生物学行为，遗憾的是目前肾癌的靶向治疗尚未充分考虑以上因素，这可能是影响肾癌靶向治疗效果的一个因素。

本研究旨在探究在转移性肾癌中原发灶和转移灶之间药物的靶点蛋白表达是否存在差异，并初步寻找造成这种差异的可能原因，为提高转移性肾癌的治疗效果做初步探索。

1　资料与方法

1.1病例资料

2009年1月至2010年1月共7例肾癌骨转移患者原发灶及转移灶标本纳入本实验，由北京大学人民医院病理科提供，本研究开始前获得北京大学人民医院伦理委员会的审查批准，标本的使用获得患者的知情同意，患者的临床病理特征见表1。

1.2试剂

多克隆抗体VEGFR、MEK、ERK购于美国Cell signaling公司，即用型二抗试剂盒及酶底物显色剂DAB等试剂购于中杉金桥生物有限公司。VEGFR-2、MEK、ERK的工作浓度(体积比)分别为1 ∶200、1 ∶25、1 ∶250，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3免疫组织化学分析及结果判定

免疫组织化学ABC法参照试剂盒说明书进行，组织芯片脱蜡、水化后，置入3%(质量分数)H2O2中室温10 min，消除内源性过氧化物酶，0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液中用微波法进行抗原修复。5%(体积分数)正常山羊血清室温封闭30 min，滴加一抗，湿盒中4 ℃孵育过夜，室温30 min滴加即用型二抗。DAB显色3 min，苏木精复染，封片。用DM2500图像分析系统(Leica公司, 德国)镜下观察，细胞质或细胞核中出现棕黄色为阳性细胞。由2名经验丰富的病理科医师采用双盲法判断结果。结果均采用双评分半定量法进行评分: 细胞阳性率<5%为1分, 5%～50%为2分,51%～100%为3分; 染色强度: 不着色为1分, 淡黄色细颗粒状为2分, 黄色颗粒状为3分, 棕黄色粗颗粒状为4分，将两个得分相乘得到其表达强度。

1.4PCR检测突变

用巢式PCR分别扩增PDGFRA基因20号外显子、K-ras基因2号外显子、Braf基因15号外显子和MEK1基因2号外显子，引物由北京三博远志公司合成。首轮PCR总反应体系为25 μL，包括模板DNA 2 μL，2×PCR mix buffer 12.5 μL，终浓度为5 μmol/L的上、下游引物各2 μL，ddH2O补足至25 μL。循环参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，51℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min。取PCR产物2 μL进行第2轮PCR扩增，步骤同上。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳初步鉴定，用ABI 3730XL测序仪测序分析，由北京三博远志公司完成，经BLAST软件比较测序结果和基因库中序列的差异。

1.5统计学分析

应用SPSS20.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间均值的差异应用配对t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

表1　 患者的一般特征

2　结果

2.1MEK、ERK蛋白在骨转移灶较肾癌原发灶表达上调

VEGFR-2主要表达于细胞膜，而MEK、ERK主要表达于细胞质，表现为出现淡黄色、黄色或棕黄色反应物。7例肾癌骨转移患者标本转移灶相比于原发灶，VEGFR-2的表达差异无统计学意义(P=0.901)，而MEK(P=0.015)和ERK(P=0.021)表达存在差异(图 1)。

图1免疫组织化学染色分析VEGFR-2、MEK、ERK在肾癌原发灶(T)及对应转移灶组织(M)中的表达
Figure 1Immunohistochemistry of VEGFR-2, MEK, ERK in primary tumor (T) and the matched metastatic tissue (M)

2.2PCR检测PDGFRA、K-ras、B-raf和MEK基因突变

7例肾癌骨转移患者的原发灶及转移灶组织中均未检测到阳性突变。

3　讨论

研究表明特定基因表达的改变可使肾癌侵袭性及转移倾向增加，且国内有学者筛选出一株特异发生骨转移的细胞系ACHN-Bo，提示肾癌骨转移患者原发灶同转移灶之间可能存在不同的基因表达[5]。Thompson等[6]的研究证实肾癌患者转移灶B7-H1高于原发灶，且高表达B7-H1的患者预后变差，分别为44.4%和54.3%。突变型p53基因的表达在转移灶比原发灶表达更高，分别为51.8% 和 22.8%，p53过表达是影响无转移生存期的独立风险因素。一项包含135例肾癌原发灶组织和41例不配对转移灶组织的研究表明[7]，mTOR-HIF通路成员中p-AKT、 p-S6、4EBP1和c-myc蛋白在转移灶中表达升高。

此外，在一项包含168例转移性肾癌患者的研究发现，靶向治疗罕能使原发灶体积缩小，进一步提示转移灶同原发灶药物靶点可能存在差异[3]。Karashima等[4]的研究表明血管生成相关基因在转移灶中表达增高，且体外细胞试验进一步证实转移癌细胞针对靶向治疗的耐药性增加，这种转移灶同原发灶对药物反应的差异性提示二者之间不同的生物学行为，遗憾的是目前肾癌的靶向治疗尚未见充分考虑以上因素，这可能是影响肾癌靶向治疗效果的一个因素。

恶性肿瘤的个体化治疗已成为肿瘤治疗中一个新的方向，泛亚太临床研究结果表明，在肺癌患者中，吉非替尼(gefitinib)对EGFR突变患者的受益率达71.2%，效果明显优于化疗，而对无突变患者受益率仅为1.1%。美国国家癌症综合治疗联盟《非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当K-ras基因发生突变时，不建议使用EGFR-TKIs靶向治疗药物。《结直肠癌临床实践指南》明确指出：(1)所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态；(2)只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂治疗。如果K-ras无突变，应考虑检测Braf基因状态，Braf基因突变率为15%。针对Braf基因突变所研发的新型靶向药物vemurafenib对于Braf基因突变阳性患者疗效显著。在血液系统，95%以上的慢性粒细胞白血病患者携带有染色体重排而导致的BCR-ABL融合基因。慢性粒细胞白血病患者主要接受酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼的治疗，并且疗效显著，然而慢性粒细胞白血病患者接受酪氨酸激酶抑制剂治疗时也会导致耐药性的产生，主要是由BCR-ABL基因T315I的突变所引起，因此，BCR-ABL基因突变检测结果是指导慢性粒细胞白血病患者用药的一个重要指标。Braf基因在原发性黑素瘤中突变率为80%，在转移性黑色素瘤中突变率为68%，在良性痣中的突变率高达82%。针对Braf基因突变所研发的新型靶向药物vemurafenib对于Braf基因突变阳性患者疗效显著，而Braf基因V600E突变是舒尼替尼治疗甲状腺癌耐药的主要机制之一[8]，BRAF位于sunitinib作用位点的下游，发生V600E突变后使得下游的MEK/ERK通路激活过表达，产生耐药。

要提高肾癌患者的预后，获得更高的生存率和改善生活质量，需要明确转移性肾癌患者原发灶与转移灶靶点表达的差异以及肾癌患者是否存在靶点相关突变，以便对肾癌患者实施个体化靶向治疗，但目前国内外尚未见针对转移性肾癌的个体化靶向治疗的研究报道，本研究对肾癌患者的sunitinib主要作用通路MEK/ERK通路靶点表达差异进行研究，发现肾癌骨转移患者转移灶MEK、ERK出现高表达，而VEGFR未见高表达，提示肾癌骨转移患者转移灶MEK/ERK通路过度激活，为进一步明确此类激活是否由VEGFR下游MEK/ERK相关基因突变导致，本课题组对已知的PDGFRAD842V突变，K-ras的12和13密码子上的G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V、G13D突变，B-rafV600E突变，MEK基因突变进行检测，并未发现突变。

本研究病例数有限，但均为配对标本，因此可排除基因表达的本底差异，虽然发现肾癌骨转移患者转移灶存在MEK/ERK通路过度激活，但尚待扩大样本进行进一步研究以发现其机制。

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(2016-04-11 收稿)

(本文编辑：王蕾)

Expression of MEK/ERK signal pathways in renal cell carcinoma with bone metastasis

QIN Cai-peng1,2, LIU Chun-lei3, ZHAO Yan-hui3, YIN Hua-qi1, DU Yi-qing1, HU Feng-zhan1, SHENG Zheng-zuo1, XU Tao1△

(1. Department of Urology, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044，China; 2. Department of Urology, Peking University International Hospital, Beijing 102206, China; 3. Department of Urology, Central Hospital of Qingdao, Qingdao 266042, Shandong, China)

Objective： To investigate the expression of MEK/ERK signaling pathways in renal cell carcinoma with bone metastasis, and to analyze the differences of expressions of VEGFR-2, MEK, ERK on the primary and metastasis tissue and its mechanism. Methods: The tissue samples were obtained from 7 renal cell carcinoma patients kindly provided by Department of Urology, Peking University People’s Hospital from January 1, 2009 to January 1, 2010. The expression of MEK/ERK signaling pathways was detected in the 7 renal cell carcinoma patients` primary and matched metastatic tissues with ICH, The antibody concentrations were 1 ∶200, 1 ∶25, and 1 ∶250, respectively. The mutation of the twentieth exon of the PDGFRA gene, the second exon of theK-rasgene, the fifteenth exon of theBrafgene and the se-cond exon of theMEK1 gene were detected with PCR. Results: The expression intensities of VEGFR-2, MEK, and ERK were measured by H-score [intensity (1, 2, 3, or 4) multiplied by the distribution (%)]. VEGFR-2, MEK, and ERK expressions were divided into 3 groups according to the positive distribution of the tumor cells: 1, 0-5%; 2, 6%-50%; and 3, >50%, To assess intratumor heterogeneity, three distinct microscopic fields (×200) from each specimen were used to evaluate the expressions, Subsequently, the scores were averaged to obtain a single concatenated score for each tissue. VEGFR-2, MEK, and ERK expressions were assessed by 2 independent pathologists who were blinded to the clinicopathological data. The data were expressed as the mean value of the triplicate experiments. The expressions of MEK, and ERK were higher in the metastatic tissues than in the matched RCC tissues (6.10±4.10vs. 1.33±0.51,P=0.015; 9.10±2.24vs. 4.43±2.84,P=0.021) while the expression of VEGFR-2 was not different between the primary and metastatic tissues (P=0.901). No mutation was detected on the twentieth exon of thePDGFRAgene, the second exon of theK-rasgene, the fifteenth exon of theBrafgene and the second exon of theMEK1 gene. Conclusion: MEK/ERK signaling pathways may play an important role in the metastasis and the resistance of sunitinib in RCC patients with bone metastasis.

Carcinoma, renal cell; MAP kinase signaling system; Neoplasm metastasis; Bone; Mutation

北京市科技计划项目(Z151100003915145)资助Supported by the Beijing Science and Technology Planning Project (Z151100003915145)

R737.1

A

1671-167X(2016)04-0590-04

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.04.004

△Corresponding author’s e-mail， xutao@medmail.com.cn

网络出版时间：2016-7-43：17：49网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160704.1317.016.html