贺元辰，厉志，韩劲松，王辉山

· 论著 ·

低温对创伤性失血性休克猪血小板ADP抑制率的影响

贺元辰1，2，厉志2，韩劲松2，王辉山2

目的 探讨在创伤性失血性休克猪模型中低温对血小板ADP抑制率的影响。方法 健康成年巴马香猪10只，建立创伤性失血性休克模型，分别在休克前（T0）、休克后1h（T1）、低温34℃（T2）、低温30℃（T3）时留取静脉血检测血小板ADP抑制率以及计算休克指数。结果 休克后ADP受体抑制率明显高于休克前［（91.83±5.63）% vs. （83.69±3.68）%］，差异有统计学意义（P＜0.01）。休克指数与ADP受体抑制率呈正相关（r=0.8343，P＜0.001）。当温度降到34℃时，ADP受体抑制率较降温前显著的下降［（84.64±4.14）% vs. （91.83±5.63）%］，差异有统计学意义（P＜0.01）。温度继续下降到30℃，ADP受体抑制率仍然继续下降［（84.64±4.14）% vs. （77.62±4.80）%］，差异有统计学意义（P ＜0.01）。结论 在创伤性失血性休克猪模型中，休克时ADP抑制率明显升高，增加出血风险，但低温使ADP受体抑制率明显下降。

低温；创伤性失血性休克；ADP抑制率

在战争期间，创伤性失血性休克（THS）经常发生，占战争士兵死亡的50%，而失血仍然是创伤后致死的主要原因之一［1］。由于严重创伤导致组织损伤，引起机体出现以凝血功能障碍为主要临床表现的临床症状，称为急性创伤后凝血病（ATC）亦称为“微血管出血”。创伤患者ATC的发生率为25%［2］，而关于ATC的研究集中在其引起的弥漫性血管内凝血（DIC）方面［3］。最近的研究表明创伤后早期的血小板抑制是组织创伤和失血性休克的主要危险因素［4］。虽然创伤后血小板计数的平均数在正常范围，但是功能已经改变。常规检验并不能确定血小板功能（除非严重紊乱），血小板图可快速识别和发现创伤中高危患者［5］。低温在临床上应用广泛，在特定的外科手术中可减少大脑、心脏和肾脏等器官的氧气需求，从而发挥保护作用。最近研究表明［4］，低温对血小板有激活作用，打破了传统的观念。创伤性失血性休克中低温对血小板的作用如何，仍不清楚。本实验研究，应用创伤性失血性休克猪模型分析低温对血小板ADP受体抑制率的作用及调控机制，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 清洁级健康成年巴马香猪10只，均为雄性，体重在17～25kg之间。合格证号SYXK（军）2007-001，黑龙江双鸭山市实创科技小型猪养殖中心提供。

1.1.2试剂和仪器 丙泊酚（上海阿斯利康有限公司），氯胺酮（广州益满生物科技有限公司），阿托品（上海谱振生物有限公司），异氟醚（江苏恒瑞医药股份有限公司）。Datex-OhmedaS/5多功能监护仪（日本E-O公司），Vigilance心排量监护仪（美国爱德华生命科学公司），中心静脉导管及肺动脉漂浮导管（美国爱德华生命科学公司），SD/SC-376BP型低温冷柜（浙江星星公司），Datex-Ohmeda9300麻醉机（美国R＆D公司），TEG5000型TEG分析仪（美国Haemoscope公司）。

1.2实验方法

1.2.1麻醉方法 麻醉诱导采用肌肉注射氯胺酮及阿托品（氯胺酮按20 mg/kg计算，阿托品为0.5 mg），浓度为1.5%～2.0%的异氟醚面罩吸入，待猪完全麻醉后行气管内插管，呼吸机辅助呼吸。呼吸参数调整为：频率14～16 次/min，潮气量按10 ml/kg设置，FiO2为25%，FiN2为75%，此模式可将PO2维持在100 mmHg左右，PCO2维持在40 mmHg左右。在无菌条件下切开右侧颈部皮肤，分离右侧颈动脉，插入导管，用于放血；将右侧腹股沟区皮肤切开，显露右侧股动脉及股静脉，分别进行动静脉穿刺并固定，用于采集血液、监测血压和中心静脉压等；将温敏电极放置直肠内用于监测直肠温度。外科操作在1 h内完成，手术过程中猪的下面使用保温毯，手术台周围用灯光进行加温，将猪的核心体温维持在38.5℃～39.5℃。操作结束后将吸入异氟醚的浓度调整为1.0%～1.5%确保猪不发生躁动（以四肢无扭动为标准），稳定1 h后开始基础检测及模型建立。

1.2.2建立模型 通过颈动脉在15 min内匀速放出全身40%的血量（按30 ml/kg体重计算）后视为休克。放血开始前记录时间为T0。在放血期间动物出现躁动等应激性表现时可给予吗啡1.5 mg静脉注射，当吗啡剂量饱和后，可换成维库溴铵静脉注射（0.2 mg/kg）。待休克后1 h记为T1，放入冰柜里进行降温使核心温度降到34℃，稳定在这个温度1 h记为T2，再将温度继续降到30℃时再稳定1 h记为T3。分别在休克前（T0）、休克后1h （T1）、低温34℃（T2）、低温30℃（T3）时留取静脉血等待检测。

1.2.3检测方法 ①血栓弹力图（TEG）检测：使用美国Haemoscope公司生产的TEG5000型TEG分析仪和分析软件（TAS），检测试剂为改良高岭土，促进剂为C-Kaolin。于各时间点采4.5 ml静脉血加入含有0.5 ml 3.2%枸橼酸钠（1：9）聚丙烯试管内，封口后上下翻转5次，使血与枸橼酸钠混合，取340 μl上样，加CaCl220μl检测。电脑记录TEG曲线参数包括：凝血反应时间（R）、凝血形成时间（K）、凝血形成速率（Angle）、凝血最终强度（MA）、凝血综合指数（CI）。②血小板图检测：TEG血小板功能分析试验分析血小板功能，测量血小板对激活剂花生四烯酸（AA）和二磷酸腺苷（ADP）的反应性。收集的样品分四次测量，分别为MAThrombin、MAFibrin、MAADP、MAAA，计算ADP受体抑制率=［（MAADP-MAFibrin）/（MAThrombin-MAFibrin）×100］和休克指数（SI）=心率/收缩压。

1.3统计学方法 所有数据处理采用SPSS 19.0软件。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间均数的比较采用t检验，休克指数与ADP受体抑制率之间的相关性采用Pearson's相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1低温及休克时血小板ADP受体抑制率的变化休克后ADP受体抑制率明显高于休克前［（91.83 ±5.63）% vs. （83.69±3.68）%］，差异有统计学意义（P＜0.01）（图1），提示休克抑制血小板的活化，导致出血的风险增加。休克指数与ADP受体抑制率呈正相关（r=0.8343，P＜0.001）（图2），说明休克越严重，血小板活化度就越差，出血的风险就越高。当温度降到34℃时，ADP受体抑制率较降温前显著的下降［（84.64± 4.14）% vs. （91.83±5.63）%］，差异有统计学意义（P＜0.01）（图3），说明低温对血小板有激活作用，而且能够对抗休克对血小板的抑制作用。温度继续下降到30℃，ADP受体抑制率仍然继续下降［（84.64±4.14）% vs. （77.62± 4.80）%］，差异有统计学意义（P＜0.01）（图4），继续加快凝血速率。

3　讨论

图1　休克前后ADP受体抑制率的变化（n=10）

图2　ADP受体抑制率与休克指数的相关分析（n=10）

图3　休克后与低温34℃ ADP受体抑制率的变化（n=10）

图4　不同温度下ADP受体抑制率的变化（n=10）

据报道，美军在阿富汗战场上的伤病员经常要在零下的环境中经过4～6 h才被送到战地医院进行进一步的救治［6］，因此在低温环境下研究创伤性失血性休克自然病程的变化显得尤为重要。猪的心血管系统及体温调控机制等与人相似，常用于研究创伤性失血性休克对血流动力学的影响，故本实验采用猪创伤性失血性休克模型。

创伤引起的急性凝血病的研究大多集中在DIC上［7，8］，在止血过程中，血小板占据重要的地位。血小板图可以在床旁测量血小板功能［9］，在临床中应用较为广泛，例如，在心脏手术中服用抗凝剂患者的ADP受体抑制率＞60%就可以确定出血并发症的风险［10-12］。但关于创伤后血小板功能的研究甚少［7］。在分析越南战争期间人员伤亡时，第一次提到早期血小板功能障碍，随后在大量输血的人群中，建议先输注血小板以减少微血管的出血［13］。近期回顾性研究表明［14］，预先输注血小板可能减少创伤性凝血病［15，16］。创伤后早期大量ADP通过组织损伤释放到体循环中，血小板过度激活致使血小板对随后的刺激无反应，导致凝血功能障碍。创伤后早期由于大量血小板反应性的降低，ADP受体抑制率的升高，血小板功能异常，这与我们的研究结果一致。

低温对血小板的作用说法不一，以往研究表明低温对血小板起到抑制作用，而最近有报道称低温对血小板起到激活的作用［4］。低温可能通过增加红细胞的比容，血小板形状的变化，降低血流量，增加粘附分子的表达，促进血小板的边集，达到增强凝血的作用。低温还可能通过增加剪切力的作用，引起血小板的聚集［17］。最初血小板活化通过有效的激活剂，例如凝血酶、ADP、胶原蛋白，而血小板激活剂ADP在低温引起血小板活化中占据着至关重要的位置。在低温中，ADP新陈代谢主要酶CD39的活性显著下降，导致较低的水解速率，ADP水解的减少将会使血浆中ADP的浓度再一次的增加，使得血小板活化，而活化的血小板又能引起自身致密颗粒释放ADP，进而吸引循环中更多的血小板，扩大了活化的途径（ADP扩大旁路）。低温还能增加血小板对激活刺激的反应能力，加强了血小板止血栓的形成和血栓的稳定性。血小板ADP受体P2Y12的阻滞减少了低温引起的血小板粘连和聚集。ADP受体的抑制和ADP的水解阻止了低温引起的血小板活化。低温对血小板主要的作用是诱发凝血事件，也就是血小板激活典型的标志（GPIIb/IIIa活化和P选择蛋白的表达）。

本实验分析了在创伤性失血性休克猪模型中低温对其血小板的影响，结果显示，低温使ADP受体抑制率明显下降，加快了凝血的速率，这也表明低温使创伤性失血性休克获益。

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本文编辑：姚雪莉

Influence of hypothermia on inhibitory rate of platelet ADP receptor in pig model of traumatic hemorrhagic shock

HE Yuan-chen*， LI Zhi， HAN Jing-song， WANG Hui-shan.*Graduate School， Fourth Military Medical University， Xi'an 710032， China.

WANG Hui-shan， E-mail: huishanwang@hotmail.com

Objective To investigate the influence of hypothermia on inhibitory rate of platelet ADP receptor in pig model of traumatic hemorrhagic shock （THS）. Methods The model of THS was established in health adult Bama miniature pigs （n=10）. The inhibitory rate of platelet ADP receptor was detected and shock index was calculated respectively before THS （T0）， 1 h after THS （T1）， and when temperature was 34℃ （T2） and was 30℃ （T3）. Results The inhibitory rate of platelet ADP receptor was significantly higher after THS than before ［（91.83±5.63）% vs. （83.69 ±3.68）%， P＜0.01］. The shock index was positively correlated to inhibitory rate of platelet ADP receptor （r=0.8343，P＜0.001）. When temperature decreased to 34℃， inhibitory rate of platelet ADP receptor decreased significantly than before ［（84.64±4.14）% vs. （91.83±5.63）%， P＜0.01］. When temperature continuously decreased to 30℃， inhibitory rate of platelet ADP receptor continuously decreased ［（84.64±4.14）% vs. （77.62±4.80）%， P＜0.01］. Conclusion In pig model of THS， the inhibitory rate of platelet ADP receptor increases significantly when shocking and bleed risk increases， while hypothermia can significantly reduce inhibitory rate of platelet ADP receptor.

Hypothermia； Traumatic hemorrhagic shock； Inhibitory rate of platelet ADP

R541.64

A

1674-4055（2016）04-0418-03

2013年军队装备研制项目重大项目（ASY13J001）

1710032 西安，第四军医大学研究生院；2110016 沈阳，沈阳军区总医院心外科

王辉山，E-mail：huishanwang@hotmail.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.04.10