张志华　郑必霞　李玫　金玉　林谦



一例Rotor综合征SLCO1B1和SLCO1B3基因突变分析

张志华郑必霞李玫金玉林谦

目的初步探讨1例Rotor综合征患者的临床特点和SLCO1B1和SLCO1B3基因突变情况，从分子遗传学角度分析该疾病的发生机制。方法收集患者临床资料，从外周血白细胞提取基因组DNA，采用二代测序进行四千种已知单基因遗传性疾病筛查，用Sanger测序法分析验证二代测序发现的突变位点。结果患儿主要临床表现为反复皮肤及巩膜黄染，实验室检查示高胆红素血症，直接、间接胆红素双向增高。高通量测序发现患儿携带SLCO1B1基因c.1738 C>T纯合突变和SLCO1B3基因c.360_481 del纯合突变。c.1738 C>T突变为无义突变，已有文献报道，推测导致蛋白的第580位氨基酸密码子由精氨酸变为终止密码子。c.360_481 del突变为移码突变，蛋白编码区的第360至481位碱基缺失。该变异未见文献报道，也未见SNP数据库收录。此变异使蛋白缺失40个氨基酸的同时还造成开放阅读框移码，可能造成蛋白功能丧失。结论SLCO1B1和SLCO1B3基因突变导致的有机阴离子转运多肽OATP1B1和OATP1B3功能缺陷是该Rotor综合征患者临床表现的分子遗传基础。

Rotor综合征；SLCO1B1基因；SLCO1B3基因

本研究分析1例Rotor综合征患者的临床特点和SLCO1B1和SLCO1B3基因突变情况，从分子遗传学角度初步探讨该疾病的发生机制。

资料和方法

一、病例资料

患者，男，11岁5个月，因反复皮肤及巩膜黄染11年入院。患儿出生后3 d患新生儿黄疸，经治疗后好转出院，1个月后再次出现皮肤及巩膜黄染，治疗后病情好转，但仍会反复出现皮肤及巩膜轻度黄染，后一直未治疗也未定期复查。2014年，家长发现患儿皮肤及巩膜再次黄染并逐渐加重，遂来就诊。入院体格检查：T 37.1 ℃，P 76次/min，R 18次/min，BP 114/68 mmHg，神志清楚，精神反应可，呼吸平稳，皮肤及巩膜轻度黄染，皮肤粗糙。全身查体未见异常。腹部B型超声：肝、胰、脾未见明显占位病变。胸腹立位X线片未见特殊。MRCP：肝内外胆管未见明显异常。

血生化检查结果：ALT 20 U/L，AST 26 U/L，总胆红素102.1 μmol/L，直接胆红素57.5 μmol/L，间接胆红素44.6 μmol/L，碱性磷酸酶181 U/L，谷氨酰转肽酶12 U/L。

二、方法

(一) DNA提取收集患者静脉抗凝血2 mL，用TIANGEN全血基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN BIOTECH CO.LTD,BEIJING)抽提患者及父母DNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

(二) 二代测序常见遗传性疾病筛查经患者父母亲同意，抽取患者外周血2 mL，委托北京德易东方临床检验所应用二代测序进行四千种已知单基因遗传性疾病筛查。

(三) PCR及一代测序验证方法取患者新鲜全血，使用BloodGen Midi Kit (CWBIO, China) 提取患者全基因组DNA，操作按照试剂盒说明书进行。根据SLCO1B1、SLCO1B3和UGT1A1基因所验证位点序列设计引物，采用PCR方法进行扩增。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s，72 ℃ 链延伸1 min，扩增30个循环；最后72 ℃补充延伸10 min。PCR 的体系均为50 μL。引物序列见表1。各基因所验证位点的PCR扩增产物，用ABI 3730XL 测序仪测序，测序引物采用原PCR引物。基因序列分析采用DNASTAR软件进行序列分析和比对。

结　　果

一、二代测序结果

四千种已知单基因遗传性疾病筛查发现3个与患者临床表现相关的可疑突变(表2)。

二、PCR及一代测序验证结果

Sanger测序结果显示患者SLCO1B1基因c.1738 C>T纯合突变(图1A)，UGT1A1基因测序结果显示c.1091C>T杂合突变(图1B)。SLCO1B3基因c.360_481 del突变进行PCR产物琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序验证。c.360_481 del区域为SLCO1B3基因整个外显子4缺失，针对该缺失区域设计引物进行PCR扩增，片段设计大小为801 bp，PCR产物1%琼脂糖电泳发现患者样本无条带，正常对照样本800 bp处有一明显条带(图1C)。进一步针对外显子4及侧翼序列Sanger测序结果验证了c.360_481 del区域缺失突变。

表1　验证位点分析引物序列

表2　基因变异位点基本信息

A. 患者SLCO1B1基因c.1738 C>T纯合突变位点测序图；B. 患者UGT1A1基因c.1091C>T杂合突变位点测序图；C. SLCO1B3基因PCR产物1%琼脂糖电泳图。1为患者样本；2为正常对照样本

图1患者基因变异位点验证

三、诊断结果

根据患儿临床主要表现为反复皮肤及巩膜黄染，实验室检查示高胆红素血症，直接、间接胆红素双向增高，肝肾功能及血常规未见异常，胆汁酸浓度不高，考虑高结合胆红素血症。根据SLCO1B1和SLCO1B3基因双纯合突变结果确诊为Rotor综合征。

讨　　论

Rotor综合征又称遗传性结合型胆红素增高Ⅱ型，属常染色体隐性遗传病，主要是由于肝细胞对胆红素和有机阴离子的摄取、储存和排泄障碍，导致血清内结合胆红素和非结合胆红素均增高[1]。出生后不久或童年开始出现间歇性黄疸。巩膜黄疸也可能是唯一的临床表现[2]。SLCO1B1和SLCO1B3双等位基因突变导致溶质载体超家族有机阴离子转运多肽OATP1B1和OATP1B3功能缺陷引起Rotor综合征[3]。SLCO1B1基因位于12p12.2-p12.1，含15个外显子，其中14个外显子编码大小为691个氨基酸残基的OATP1B1蛋白[4]。SLCO1B3基因位于12p12.2，同样含15个外显子，其中14个外显子编码大小为702个氨基酸残基的OATP1B3蛋白[4]。OATP1B1和OATP1B3均在肝细胞中表达[5]。人类基因突变数据库(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)中目前收录了25种SLCO1B1突变，以错义突变和无义突变为主。目前报道的SLCO1B3基因突变仅5种，均为错义突变。

Rotor综合征以间歇性黄疸为主要临床表现，本例患儿出生后3 d起病，因反复皮肤及巩膜黄染11年入院，实验室检查示高胆红素血症，直接、间接胆红素双向增高。基因筛查检出了SLCO1B1基因的一个纯合变异：c.1738 C>T(p.580R>X)，使蛋白的第580位氨基酸密码子由精氨酸(Arg，R)密码子变为终止密码子。该变异已有文献报道，被SNP数据库收录(rs71581941)，SNP数据库中等位基因T的分布率为0.0051，千人基因组中等位基因T在北京汉族和南方汉族的分布率分别为0和0.02。此变异使蛋白合成提前终止，推测造成蛋白功能丧失。患儿还被检出SLCO1B3基因的一个纯合变异：c.360_481 del，蛋白编码区的第360至481位碱基缺失。该变异未见文献报道，也未见SNP数据库收录。此变异使蛋白缺失40个氨基酸的同时还造成开放阅读框移码，可能造成蛋白功能丧失。因此，SLCO1B1和SLCO1B3基因两个纯合突变引起的溶质载体有机阴离子转运载体蛋白家族OATP1B1和OATP1B3功能缺陷应该是本例患儿Rotor综合征发病的分子机制。

本例患儿同时被检出了UGT1A1基因的一个杂合变异：[c.1091C>T，p.364P>L]，使蛋白的第364位氨基酸由脯氨酸(Pro，P)变为亮氨酸(Leu，L)。该变异已被SNP数据库收录(rs34946978)，SNP数据库中等位基因T的分布率为0.0046，千人基因组中等位基因T在北京汉族和南方汉族的分布率分别为0.0258和0.025。蛋白结构预测其有害，目前尚无功能或临床研究证实其致病可靠性。UGT1A1基因的纯合或复合杂合突变可能导致以间接胆红素增高为主的遗传Crigler-Najjar综合征1型(OMIM：218800)或Crigler-Najjar综合征2型(OMIM：606785)；UGT1A1基因的杂合、纯合或复合杂合突变都可能导致Gilbert综合征(OMIM：143500)[6]。

Rotor综合征在临床上极为罕见，发病率未知，预

后良好，无需特殊治疗。临床上主要表现为黄疸，一般无其他症状，易与其他黄疸性疾病混淆[7]。以往诊断主要是在排除感染性肝炎及梗阻性黄疸后，依靠肝脏穿刺检查发现肝细胞内无特异色素颗粒沉着，从而与遗传性结合胆红素增高Ⅰ型(Dubin-Johnson综合征)鉴别。随着分子生物学技术的快速发展，SLCO1B1和SLCO1B3基因突变分析可以作为该病的主要确诊方法。

[1]Lee WS, McKiernan PJ, Beath SV, et al. Bile bilirubin pigment analysis in disorders of bilirubin metabolism in early infancy. Arch Dis Child, 2001, 85:38-42.

[2]Teh CP, Nevard CH, Lawson N. Clinical quiz. Dubin-Johnson syndrome or Rotor syndrome. Pediatr Nephrol, 1999, 13:627-628.

[3]van de Steeg E, Stráneck V, Hartmannová H, et al. Complete OATP1B1 and OATP1B3 deficiency causes human Rotor syndrome by interrupting conjugated bilirubin reuptake into the liver. J Clin Invest, 2012, 122:519-528.

[4]Kim SR, Saito Y, Sai K, et al. Genetic variations and frequencies of major haplotypes in SLCO1B1 encoding the transporter OATP1B1 in Japanese subjects: SLCO1B1*17 is more prevalent than *15. Drug Metab Pharmacokinet, 2007,22:456-461.

[5]Shitara Y. Clinical importance of OATP1B1 and OATP1B3 in drug-drug interactions. Drug Metab Pharmacokinet,2011, 26:220-227.

[6]Watchko JF. Genetics and pediatric unconjugated hyperbilirubinemia. J Pediatr, 2013,162:1092-1094.

[7]Strassburg CP. Hyperbilirubinemia syndromes (Gilbert-Meulengracht, Crigler-Najjar, Dubin-Johnson, and Rotor syndrome). Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2010, 24:555-571.

(本文编辑：钱燕)

SLCO1B1 and SLCO1B3 gene mutations in a Chinese boy with Rotor syndrome: a case report

ZHANGZhi-hua,ZHENGBi-xia,LIMei,JINYu,LINQian.

NanjingChildren'sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,ChinaCorrespondingauthor:LINQian,Email:j_inc@126.com

ObjectiveTo investigate the SLCO1B1 and SLCO1B3 gene mutations and clinical features in a Chinese patient with Rotor syndrome. MethodsThe clinical data of the patient was collected. Genomic DNA was extracted from peripheral white blood cells and subjected for second-generation sequencing to screen 4000 known genes for single genetic diseases. Then the detected mutations were confirmed by Sanger sequencing analysis. ResultsThe main clinical manifestations were recurrent yellowish skin and sclera. Laboratory examinations showed as hyperbilirubinemia with both direct and indirect bilirubin elevating. SLCO1B1 gene c.1738 C>T homozygous mutation and SLCO1B3 gene c.360_481 del homozygous mutation were found by high throughput sequencing. C.1738 C>T mutation, a nonsense mutation reported in references, was speculated to causes the conversion of 580th amino acid codons from arginine to a stop codon in protein. And C.360_481 del mutation was a frameshift mutation that caused the nucleotide deletion from 360 th to 481 th in the protein coding region, but it was neither reported in the references nor recorded in SNP database. The frameshift caused deletion of 40 amino acids and code shifting of open reading frame, which might lead to the protein function loss. ConclusionSLCO1B1 and SLCO1B3 gene mutations result in dysfunction of organic anion transporting polypeptide OATP1B and OATP1B3, which is the molecular genetics foundation in the case of Rotor syndrome. This is the first report of Rotor syndrome with SLCO1B1 and SLCO1B3 gene mutations analysis in Chinese population.

Rotor syndrome；SLCO1B1 gene；SLCO1B3 gene

2016-02-03)

210008南京医科大学附属南京儿童医院消化科

林谦，Email：j_inc@126.com