滕旭　许赤　孟炜　李晓华



细胞自噬及相关因子在老年肝外伤中的表达及意义

滕旭许赤孟炜李晓华

目的研究细胞自噬及相关因子在老年肝外伤中的表达，探讨在老年肝脏缺血再灌注损伤中诱导老年肝细胞自噬的分子机制。方法选取不同鼠龄的大鼠，建立老年大鼠肝外伤缺血再灌注损伤的模型，通过采用电子显微镜、免疫印迹和荧光显微镜等方法观察细胞自噬与细胞凋亡，研究因子Bcl-2及Beclin 1在细胞自噬/细胞凋亡之间的调控关系。结果Beclin 1在老年大鼠肝外伤再灌注期表达明显增多，而Bcl-2的表达下调(P<0.01), Bcl-2和Beclin 1平衡状态失调，免疫印迹表明Beclin 1阳性细胞百分率(40.8±10.6)%与Bcl-2(17.6±5.2)%比较差异有统计学意义(P<0.01),而在中晚期阶段(外伤后3～6月)，Bcl-2表达下调的作用减缓，同时也激活Beclin 1激活自噬，此时年轻大鼠与老年大鼠的肝功能检测及病理切片检查差异不大(P>0.01)。结论Bcl-2与Beclin 1在老年肝脏缺血再灌注损伤的分子机制中可能发挥着重要作用。

老年肝脏；缺血再灌注损伤；细胞因子调节

细胞自噬直接参与器官损伤术后缺血再灌注损伤。长期临床和实验研究发现，老年大鼠肝脏外伤后，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,可以激活Beclin 1诱导细胞自噬。但是Bcl-2及Beclin 1在老年大鼠肝外伤术后不同时期的诱导细胞自噬/细胞凋亡，发挥细胞保护/细胞损伤作用的调控机制尚不清楚。本研究建立老年大鼠肝外伤缺血再灌注损伤的模型，通过电子显微镜、免疫印迹和荧光显微镜等方法，观察细胞自噬与细胞凋亡，研究Bcl-2及Beclin 1与细胞自噬/细胞凋亡之间的调控关系，探讨在老年肝脏的缺血再灌注损伤中诱导老年肝细胞自噬的分子机制。以期为老年肝外伤的合理治疗提供依据，同时探讨严格的治疗年龄标准，以保证手术质量，提高老年肝外伤的手术疗效。

资料和方法

一、试验材料

选取不同年龄的大鼠来进行比较。根据大鼠鼠龄分组：(1)青年组：鼠龄6月；(2)鼠龄17月组；(3)鼠龄20月组；(4)鼠龄23月组；(5)鼠龄26月组。每组分为2个亚组，其中一组，术前2 d至术后3 d雷帕霉素灌胃[0.2 mg/(kg·d)]。选择成年大鼠，体型匹配，鼠龄均为6月作为对照，每组30例。每例大鼠肝修整时，取3×1×1 mm3大小的肝组织2～3份，置于冷藏的 2.5%戊二醛前固定，备电子显微镜检查；切取肝组织10%甲醛固定，备病理学检查。其中6例分别于术后1、3、7 d断尾取血1 mL，测血清ALT和GGT；分别于术后1、3、7 d处死2只，分别于术后3月和6月处死6只，快速取肝组织2～3份，置于冷藏的2.5%戊二醛前固定，备电子显微镜检查。取肝组织10%甲醛固定，备病理学检查。

二、实验方法

①电子显微镜观察：预固定标本，2 h后更换磷酸盐缓冲液，1%锇酸固定2 h，丙酮脱水，618环氧树脂包埋，60℃固化，按电镜观察要求制成0.2 μm厚的超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅双重片染，日立H-600型透射电镜下观察。

②取新鲜大鼠肝组织，用0.25%的EDTA-胶原酶分离原代肝细胞。制成细胞悬液，吸干后加入1×测定/裂解缓冲液[50 mM乙磺酸(Hepes)(pH 7.4), 140 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM乙二醇双四乙酸(EGTA), 0.4% NP-40, 10 mM焦磷酸, 5 mM钒酸内Na3VO4, 1 μg/mL亮抑酶肽，1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)]，反复冰冻，获得细胞裂解液，将细胞裂解产物移至离心管中，14,000×g，4℃离心10 min，收集上清至离心管中，做western blot检测，以每孔20 μL上样，电泳，转膜，脱脂奶粉封闭后，分别加入LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Bcl-2、Beclin 1等Rabbit mAb，4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜后二抗孵育，ECL底片显影分析。

③免疫组织染色：根据术后不同时间点，腹腔注射2%戊巴比妥麻醉大鼠，活体心脏灌注10 mL生理盐水，将循环血冲洗干净。通过心脏再灌注10 mL 4%多聚甲醛进行固定，然后再灌注10 mL生理盐水，肝组织置于4%多聚甲醛中固定24 h后，放入20%蔗糖溶液中脱水过夜，将标本保存于-80℃。送往病理科作病理切片，切成5 μm的切片，保存于-20℃，进行免疫荧光组织染色。

三、统计学分析

结　　果

一、老年肝细胞缺血再灌注的超微病理结构变化

透视电镜扫描表明，缺血再灌注早期老年肝细胞核膜上绒毛样突起增多，胞浆内有大量空泡，粗面内质网增多。(见图1)

图1　透视电镜扫描老年肝细胞缺血再灌注超微病理结构

二、荧光定量PCR检测Bcl-2、Beclin 1等细胞自噬过程中所产生相关因子的表达水平变化

结果显示，老年肝细胞缺血再灌注的Beclin 1阳性细胞百分率(40.8±10.6)%与Bcl-2(17.6±5.2)%比较差异有统计学意义(P<0.01),而在中晚期阶段(外伤后3～6月)，Bcl-2表达下调的作用减缓，同时也激活Beclin 1来激活自噬，此时Bcl-2与Beclin 1的表达基本达到平衡状态(P>0.01)(见表1)。

三、Western印迹检测Bcl-2与Beclin 1的表达

结果显示，老年大鼠肝外伤后缺血再灌注期肝细胞中Beclin 1的表达较强，蛋白表达条带清晰可见，而Bcl-2则表达较少，两者差异有统计学意义(P<0.01)(见图2)。

图2　Western bloting检测Bcl-2、Beclin 1蛋白表达情况

四、老年大鼠肝外伤的肝功能检测

包括ALT、AST、TBil、rGT、TP、每周2～3次，结果显示老年大鼠肝外伤后TBil、ALT等在不同时期的肝功能比较，与对照组(青年大鼠组)差异无统计学意义(表2)。

表1　大鼠肝细胞自噬过程中Bcl-2与Beclin 1在不同时期的变化比较(n=30，±s)

表2　试验大鼠肝外伤后不同时期的肝功能指标情况(±s)

讨　　论

临床发现年龄仅为影响因素之一，与老年关系较为密切的是营养不良所致的贫血、免疫功能降低、组织结构退化等增加多脏器功能障碍的危险[1,2]，而术后缺血再灌注损伤是影响老年肝脏外伤术后疗效的关键，健康的老年患者术后仍然有较好的肝功能，可获得满意疗效[3,4]。相比心、肺、肾等其他脏器,老年肝脏显示“功能特惠” 现象，而目前国内外研究较少，结论也不一致。我们面临的主要问题是老年肝脏的缺血再灌注损伤是否可像年轻肝脏一样恢复功能？手术后是否可长期生存？其机制是什么？

研究表明，Bcl-2和Beclin 1相互作用影响自噬的功能，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，对自噬也起一定作用[5]。课题组通过对长期临床数据的整理、回顾研究发现老年肝脏损伤术后5～7 d，肝功能恢复延迟，而中长期肝功能恢复与年轻肝脏相比，差异不大。尽管研究表明老年肝脏的功能随年龄增加而降低的趋势，但是鼠龄低于23月的老年大鼠(相当于人类75岁)在肝外伤术后仍然可恢复功能[6]。研究发现，在老年肝脏的缺血/再灌注中，Bcl-2表达下调增加，诱发凋亡增加，虽然通过激活Beclin 1来激活自噬，此时凋亡作用大于自噬保护作用，导致肝功能恢复延迟。在中长期恢复阶段，Bcl-2表达下调的作用减缓，同时也激活Beclin 1来激活自噬，此时自噬保护作用大于凋亡作用，导致肝功能恢复与年轻肝脏相比，差异不大。但在老年肝脏中Bcl-2和Beclin 1的之间相互作用如何调控细胞自噬及细胞凋亡信号通路？在老年肝外伤术后缺血/再灌注对肝脏功能恢复有何影响？均是亟须回答的科学问题。通过细胞自噬/细胞凋亡调节机制的研究，探索老年肝外伤术后，肝脏生存期延长的可能机制，同时可望寻找到反映肝脏的缺血/再灌注损伤的可靠指标；一方面临床需要为老年肝外伤的治疗提供更为严格的年龄上限标准；另一方面，探讨具有“功能特惠”特点的老年肝脏外伤后恢复机能的生理机制，以期缩短康复时间，减轻患者费用负担，具有巨大的社会效益。

细胞自噬最早1962年在电子显微镜下被观察到，在生理情况下其在清除无用的、多余的、受损的或癌变的细胞器,维持机体内环境稳态方面发挥重要作用，在病理情况下也起了重要的作用[7-10]。有研究表明自噬和肝脏缺血/再灌注关系密切。而关于细胞自噬在肝脏缺血再灌注损伤中的作用争议不一：发挥细胞保护作用[11]？还是促进细胞死亡[12, 13]？有大量文献报道，自噬在慢性肝脏缺血中发挥细胞保护作用，仍有研究表明自噬可促进细胞死亡[14]。Matsui等[15]研究表明，在缺血阶段自噬起的是保护作用,而在再灌注阶段自噬却是有害的。目前的研究表明，急慢性肝脏缺血可以诱导自噬, 而再灌注可以进一步强化自噬体的形成; 但过于严重和时间太长的缺血却可以抑制自噬;更重要的是,如果自噬不适当的激活可能会加速细胞死亡。

对细胞自噬过程的研究发现，Bcl-2和Beclin 1的相互作用可能在器官外伤后的缺血再灌注损伤发挥重要的作用。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，对自噬也起一定作用[16-17]。研究发现，Beclin 1在再灌注时表达明显增多,Bcl-2和Beclin 1的平衡状态失调,此时凋亡作用大于自噬保护作用,结果是促进了细胞死亡。

肝脏具有很强的新陈代谢能力,能够产生大量的自由基[18-19]。Bcl-2是研究最早的凋亡相关基因, 其家族蛋白在此通路中起到关键性的调控作用[20]。Bcl-2对各种刺激诱导的凋亡有阻抑效应，在衰老细胞里，Bcl-2表达降低[19-23]。临床研究也发现，老年全肝血流阻断下肝外伤术后3～5 d，肝功能恢复延迟，而中长期肝功能恢复与年轻肝脏相比，差异不大。本研究从细胞凋亡信号通路以及细胞自噬调控的角度，研究Bcl-2和Beclin 1对老年肝外伤术后缺血/再灌注损伤的保护作用及分子机制，以期对老年肝外伤年龄上限的治疗选择及合理治疗提供理论指导作用。

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(本文编辑：易玲)

2016-02-20)

518117广东广东省深圳市龙岗区第六人民医院普外科(滕旭)；中山大学附属三院肝外科(许赤，孟炜，李晓华)