湛　亚，王淑琪，何莎莎，王　颖，刘姬艳

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)



GSNO对人鼻咽癌细胞增殖的影响

湛亚，王淑琪，何莎莎，王颖，刘姬艳

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

摘要：采取GSH和NaNO2(1∶1)在酸性避光条件下反应的方法合成GSNO，用已构建的人鼻咽癌细胞(CNE-2)为模型，研究GSNO对CNE-2细胞增殖的影响.结果表明：NO能明显抑制CNE-2细胞增殖，200 μmol/L GSNO作用CNE-2细胞，12 h抑制率为19.1%，24 h抑制率为30.4%.在一定浓度范围内，GSNO抑制CNE-2细胞的生长增殖效果与作用时间和浓度相关.

关键词：亚硝基谷胱甘肽；人鼻咽癌细胞株；MTT检测法

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方常见的恶性肿瘤之一，为耳鼻喉科最常见的恶性肿瘤，每年发病率高达25～30/10万人[1].鼻咽癌的发病因素与多种致癌因素相关，如EB病毒感染、环境因素、遗传因素、饮食习惯等[2].目前临床使用的化学药物虽然在肿瘤治疗方面取得一定的疗效，但远期效果不理想并存在有严重的毒副反应[3].

Hibbs发现由活化的巨噬细胞产生的一氧化氮(NO)是杀伤肿瘤细胞的毒性效应因子以来，已有大量资料证明，NO在肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、转移及凋亡中也起着重要作用[4-8].NO是一种小分子物质，可溶于水，具有亲脂性，可穿透生物膜.作为一种自由基性质的气体，NO可作用于细胞内的靶分子而参与一系列生理和病理条件下的生物过程，调节免疫、神经、循环等一系列生理活动，如宿主防御反应、血管通透性、血管扩张、神经信号传递等[9-15].内源性NO是一种极不稳定的化合物，在实验条件下，其半衰期仅为3～5 s，对研究其功能带来不便.亚硝基谷胱甘肽(nitrosoglutathione, GSNO)比NO稳定，半衰期长，具脂溶性特征，可穿透细胞膜进入细胞并释放NO，进而使NO发挥其生物学活性[16].本研究以NO供体GSNO作为工具药，用已构建的人鼻咽癌细胞(Human nasopharyngeal carcinoma cell, CNE-2)为模型，研究GSNO对CNE-2细胞增殖的影响.

1材料和方法

1.1实验材料及仪器

CNE-2细胞株系(浙江医院馈赠)，还原性谷胱甘肽(GSH)(上海晶纯生化科技股份有限公司)，N-乙酰半胱氨酸(NAC)(上海晶纯生化科技股份有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(凯基生物材料有限公司).

相差倒置显微镜(NikonT1-SM120)；752型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；酶联免疫检测仪(Biorad)；荧光显微镜(LeicaZEISS HAL 100).

1.2细胞培养

人鼻咽癌细胞CNE-2贴壁培养于含10%灭活胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件的细胞培养箱中培养.当细胞贴壁生长到铺满培养容器底部90%以上，进行细胞传代.细胞传代以PBS洗涤细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，2～3 d传代一次，细胞传代7次内取对数生长期且状态良好的细胞进行实验.

1.3GSNO的合成与定量

GSNO不稳定，一般采取现配现用的方式[17]，采用GSH和NaNO2在酸性避光条件下反应合成.

合成：400 mmol/L GSH 0.4 mL，加入200 mmol/L HCL 0.2 mL，然后加入400 mmol/L NaNO20.2 mL，混合避光室温反应15 min，加入40%NaOH(约3～4 μL), 调整pH=7.2，避光保存于冰浴上.

定量：利用分光光度计定量.以蒸馏水调零，将合成的产物稀释200倍后，测定在334 nm处的吸光度值.所得的吸光度值与摩尔吸光系数0.767相比，然后乘以稀释倍数，即求得合成的GSNO的浓度.

1.4MTT法检测GSNO对CNE-2细胞增殖的影响

收集对数生长期的细胞接种于96孔培养板中，每孔含1.0×104个细胞.培养过夜后，分别用50、100、200、400、800 μmol/L GSNO处理12、24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃，5%CO2及饱和湿度的条件下继续培养4 h，每孔加入MTT裂解液 (10%SDS，5%异丁醇，0.012 mmol/L HCL)100 μL，37 ℃，5%CO2及饱和湿度的条件下放置过夜后，用Biorad酶标仪在570 nm波长处测量各孔吸收值，调零孔则用RPMI-1640培养液代替细胞悬液和药液.每次实验3个复孔，独立实验重复3次.细胞生长抑制率按下列公式计算：

进行NO干预试剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)5 mmol/L(NAC用RPMI-1640溶液溶解稀释)对GSNO作用的影响检测时，传代细胞贴壁生长到铺满培养容器底部80%左右，预先加入干扰试剂NAC，37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下孵育30 min，再加入GSNO(200 μmol/L)继续培养24 h，再用MTT法检测对细胞增殖的影响.

1.5形态学观察

将盖玻片用75%乙醇浸泡后，PBS冲洗2遍，10%胎牛血清的RPMI-1640培养液冲洗一遍后，放置于6孔板中.收集对数生长期CNE-2细胞接种于6孔培养板中，每孔含4×105个细胞.培养过夜，待贴壁生长到铺满培养容器底部80%左右后，200 μmol/L GSNO 作用12 h，对照组加入同体积的RPMI-1640培养液.取出细胞爬片置于载玻片上，置倒置显微镜下观察，照相并记录实验结果.

吸去培养液，用4%多聚甲醛固定，PBST(含0.1%Tween-20，0.5%Triton100的PBS)洗涤，再加入Hochest 33342室温暗处理20 min，用PBST洗涤.封片再置于荧光显微镜下观察.激发波长350 nm，发射波长460 nm.

1.6统计学方法

2结果

2.1MTT法检测GSNO对CNE-2细胞增殖的影响

2.1.1不同浓度GSNO处理不同时间对CNE-2细胞增殖的影响

通过使用不同终浓度的GSNO作用于CNE-2细胞，分别处理12、24 h后，结果表明，GSNO可明显抑制CNE-2细胞的生长增殖，其效果与作用时间和浓度相关(图1).同一作用时间内，GSNO处理24 h，对细胞生长的抑制率随GSNO剂量的增加而上升(P<0.05)；200 μmol/L GSNO作用CNE-2细胞，12 h抑制率为19.1%，24 h抑制率为30.4%，呈时间梯度变化.

2.1.2NO清除剂对GSNO处理的CNE-2细胞增殖的影响

通过将CNE-2细胞分别用GSNO(200 μmol/L)，N-乙酰半胱氨酸(NO清除剂，5 mmol/L)及N-乙酰半胱氨酸5 mmol/L+GSNO 200 μmol/L 联合处理24 h，检测对CNE-2细胞增殖的影响.结果如图2所示：单独的N-乙酰半胱氨酸组对CNE-2细胞的生长抑制率明显低于GSNO组(P<0.05)，与对照组相比没有明显的区别(P>0.05).N-乙酰半胱氨酸+GSNO组对CNE-2细胞的生长抑制率低于GSNO组(P<0.05)，表明NAC预处理减弱了GSNO对CNE-2细胞的生长抑制效应.

图1　GSNO对CNE-2细胞增殖的抑制作用Fig. 1　Inhibitory effect of GSNO on the proliferation of CNE-2 cells

图2　NO清除剂对GNSO处理的CNE-2细胞生长增殖的影响Fig. 2　Effect of NO scavenger on the proliferation of CNE-2 cells treated with GNSO

2.2GSNO作用于CNE-2细胞的形态学观察

2.2.1倒置显微镜观察

在倒置显微镜下，对照组CNE-2细胞贴壁生长，形态呈现不规则多边形，细胞生长密集，相邻细胞紧密连接成片；200 μmol/L GSNO作用12 h后的CNE-2细胞，各细胞间接触性下降，细胞分布变得稀疏，细胞形态开始由多边形变为圆形，部分细胞外围出现一层小泡，细胞核初步聚集，细胞胞浆逐渐浓缩(图3).

图3　倒置显微镜观察GSNO处理的CNE-2细胞的形态学改变Fig. 3　Morphological changes of CNE-2 cells treated by GSNO were observed by electron microscope

2.2.2荧光显微镜观察

Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜，嵌入细胞核双链DNA的细胞核蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低.结果(图4)显示:对照组CNE-2细胞的细胞核呈蓝色；200 μmol/L GSNO作用12 h后的CNE-2细胞，细胞质发生固缩，细胞核致密开始出现浓缩，细胞核颜色开始由蓝色变为亮蓝色.

图4　荧光显微镜观察GSNO处理的CNE-2细胞的形态学改变Fig. 4　Fluorescence microscopy was used to observe the morphological changes of CNE-2 cells treated with GSNO

3讨论

目前临床采用化学药物治疗鼻咽癌虽取得了一定的进展，但在提高远期治疗效果、降低毒副反应和提高鼻咽癌患者生存质量方面还需做很大努力，因此需要寻找更为精确有效的鼻咽癌治疗药物及治疗靶点[18].

已有资料表明，NO可抑制包括肿瘤细胞在内的多种细胞生长增殖，并诱导细胞凋亡.张新宇等[19]通过将不同浓度的NO供体硝普钠(Sodium Nitroprusside，SNP)作用于体外培养的骨肉瘤细胞株(HOS)，结果表明200 μmol/L SNP对HOS细胞生长有明显抑制作用.蒋雪梅等[20]通过对人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2的研究，发现NO可抑制人肝癌细胞生长增殖，诱导细胞凋亡及死亡.余红民等[21]研究发现GSNO能促使人肺腺癌A549细胞凋亡，并进一步发现其作用机制可能与巯基亚硝基化修饰作用有关.

蛋白质巯基亚硝基化修饰是指NO对蛋白质半胱氨酸巯基共价修饰，将蛋白质半胱氨酸巯基(-SH)转化为巯亚硝基(-SNO)的过程，是一种依赖NO的巯基氧化修饰，包括NO对蛋白质半胱氨酸巯基的直接亚硝基化和利用中间产物进行的转亚硝基化两种方式.在细胞中，转亚硝基化的方式更为普遍[22].GSNO作为一种低分子量的巯基亚硝基化合物，它比NO稳定也更加方便NO发挥其生物活性.在转亚硝基化途径中，GSNO可作为其中间产物将NO反式转移到蛋白质半胱氨酸巯基(Cys-SH)上，发生转亚硝基化作用，接着参与后续调控.研究表明，蛋白质巯基亚硝基化产物在多种疾病中表现出升高或降低异常，蛋白质巯基亚硝基化调控有可能成为肿瘤治疗的一个新途径[23].

本研究将不同浓度的GSNO作用于人鼻咽癌CNE-2细胞，结果表明：NO能明显抑制CNE-2细胞增殖，200 μmol/L GSNO作用CNE-2细胞，12 h抑制率为19.1%，24 h抑制率为30.4%，呈时间梯度变化.在一定浓度范围内，GSNO抑制CNE-2细胞的生长增殖效果与作用时间和浓度相关.CNE-2细胞经200 μmol/L GSNO作用12 h后，细胞形态开始发生变化，细胞开始变圆，细胞分布变得松散，部分细胞周边出现一层小泡.经Hoechst 33342染色后，细胞核致密开始出现浓缩.

综上所述，本文研究结果表明GSNO能明显抑制人鼻咽癌细胞的增殖，在一定浓度范围内，作用效果与时间和浓度相关.这一研究结果为临床治疗鼻咽癌提供了一个新的思路，而NO相关的作用机理还需进一步的研究.

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收稿日期：2016-03-03

基金项目：浙江省自然科学基金项目(LQ13H310005)；杭州师范大学本科生创新能力提升工程项目(CX2014085).

通信作者：刘姬艳(1979—)，女，副教授，博士，主要从事细胞生物学研究.E-mail: liujiyan_grace@163.com

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2016.04.008

中图分类号:R282.71

文献标志码:A

文章编号:1674-232X(2016)04-0377-05

Effects of GSNO on the Proliferation of Human Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line

ZHAN Ya, WANG Shuqi, HE Shasha, WANG Ying, LIU Jiyan

(College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Abstract:GSNO was synthesized by the reaction of GSH and NaNO2 under the condition of acid shelter, the effects of GSNO on the proliferation of CNE-2 cells were studied with the constructed human nasopharyngeal carcinoma cell line as a model. The results showed that NO could obviously inhibit the proliferation of CNE-2 cells, 200 μmol/L GSNO CNE-2 cells, 12 h inhibition rate was 19.1 %, 24 h inhibition rate was 30.4 %. In a certain concentration range, the inhibition of GSNO on the growth of CNE-2 cell proliferation effect related to the reaction time and concentration.

Key words:GSNO； Human nasopharyngeal carcinoma cell line； MTT detection method