王　莹

(辽宁中医药大学附属医院 输血科,辽宁 沈阳110032)



疑难ABO血型标本的表型与相应等位基因的检测

王莹

(辽宁中医药大学附属医院 输血科,辽宁 沈阳110032)

摘要：目的探讨分析疑难ABO血型标本与其等位基因的检测，为临床遇到的疑难ABO血型标本提供可靠的血型鉴定方法。方法选取2013年8月到2014年8月期间在笔者就职医院各科室送检的临床病人血液样本9例，首先按照常规血型检测技术进行ABO血型血清学试验，确定ABO正反定型，再采用盐酸胍/蛋白酶K裂解提取法对ETDA抗凝处理后的静脉外周血进行DNA提取，再使用聚合酶链反应- 序列特异性引物法( PCR- SSP)对9例血样进行ABO 血型基因分型检测。结果9例临床病人血清学表型为：AxB 2例、AB亚1例、A亚B亚1例，Ax 2例，B亚3例，9例患者基因型分别为为：A/B 4例,A/O 2例,B/O 3例,通过PCR-SSP检测所得基因型与血清学表型结果相一致。结论利用聚合酶链反应- 序列特异性引物法( PCR- SSP)对血清学方法鉴定ABO血型结果为正反不定型的疑难血型标本进行基因型检测，能准确地确定患者的血型抗原，为临床疑难ABO血型患者制定安全有效的用血方案提供保障。

关键词：疑难ABO血型标本； 等位基因；聚合酶链反应- 序列特异性引物法

(ChinJLabDiagn,2016,20:1113)

自1900年奥地利维也纳大学的Dr.Landsteiner提出ABO血型系统以来，ABO血型系统一直是临床用血时起至关重要的血型系统，由于ABO血型系统具有多种亚型包括Aw型、A3型、Ael型、ABx型、AwB型、AxB型、A3B型等，又或者机体存在疾病干扰了血型表型，自身抗体导致红细胞致敏及RhD变异出现弱D和极弱D的情况，在这些情况下常规的血清学检测往往对这些发生抗原抗体不规则反应的疑难ABO血型标本无法做出准确鉴别，无法制定用血计划对临床患者的用血造成了不便。近年来DNA分子检测技术的不断发展为准确鉴别这些疑难ABO血型标本亚型提供了新的可能[1,2]。笔者通过稳定的PCR-SSP技术对笔者所在医院各科室送检的疑难 ABO 血型标本进行了ABO基因型测定，解决了9例疑难ABO血型标本的鉴定，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2013年8月到2014年8月期间笔者就职医院各科室送检的临床病人血液样本9例，均采用EDTA-K2抗凝。

1.2研究方法1.2.1常规血清学技术检测血样血清学分型所有血样检测所用的抗A抗体、抗A1抗体、抗B抗体、抗AB抗体及抗H抗体均为同一家公司制备，用于检测的ABO试剂则由笔者所在医院自行制备。

1.2.2DNA提取将所选的9例患者经EDTA-K2抗凝的全血5mL按照盐酸胍/蛋白酶K裂解提取法进行目的基因提取，最终得到300 μl左右的DNA。

1.2.3PCR扩增①设计引物，按照ABO核苷酸序列设计特异性引物，以HGH作为内对照基因，HGH5G-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3C,5C-TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3C；其余序列分别为：(1)Mix-15i-AGGAAGGATGTCCTCGTGGTA-3G，5G-GCCCACGTGGTCGCGGAAC-3C(2)Mix-25i-GGAAGGATGTGCTCGTGGTGA-3G，5G-CCCCGAAGAACCCCCCCAG-3C(3)Mix-35i- GGAAGGATGTGCTCGTGGTGA-3G，5G-GCCCACGTGGTCGCGGATC-3C(4)Mix-45i- AGGAAGGATGTCCTCGTGGTA-3G，5G-G-

CCCACGTGGTCGCGGATC-3C(5)Mix-55i-GGAAGGATGTGCTCGTGGTGA-3G，5G-CCCC-

GAAGAACGCCCCCAT-3C(6)Mix-65i-GGAAG-

GATGTGCTCGTGGTGA-3G，5G-TGCTTCCGTAGAAGCTGGG-3G，均为美国G&T公司试剂盒内所配。②PCR扩增，在热启动技术下将体积为1 μl的提取的目的基因，1 μl的美国Promega公司所购的Taq Polymerase即DNA聚合酶，以及由特异性引物、dNTPs，缓冲液和内对照引物混合而成的7 μl SIGMA公司所产的HLA基因分型引物，共计总体积为9 μl的PCR反应物在95℃进行5 min的预热后，于95℃下变性30s，60℃下退火30 s，72℃下进行1.5 min的延伸，上述操作过程循环进行30次，完成后在72℃下延伸5 min,最后降温到4℃。

1.2.4利用凝胶电泳进行PCR产物分析对PCR最后所得产物进行凝胶电泳，均采用由同种缓冲液制备的2%琼脂糖凝胶，进行EB染色后在100 V电压下进行20 min的电泳，并于紫外线灯下拍照记录电泳结果。

1.2.5电泳结果判定记录的电泳结果中有特异性扩增产物的为阳性反应，其ABO基因型的判定如图1。

1为O基因电泳图谱，2为B基因电泳图谱，3为A201基因电泳图谱，4为A基因电泳图谱

2结果

2.19例临床病人血清学表型结果

9例临床病人血清学表型为：AxB 2例、AB亚1例、A亚B亚1例，Ax 2例，B亚3例，详见表1。

表1　9例临床病人血清学表型结果

2.29例患者基因型及PCR结果

9例患者基因型分别为为：A/B 4例,A/O 2例,B/O 3例,通过PCR-SSP检测所得基因型与血清学表型结果相一致，详见表2。

表2　9例患者基因型及PCR结果

3讨论

在人类红细胞的表面存在多种抗原，这些同种异型抗原分类组合即血型系统，已知的血型系统有80余种血型系统，包括ABO型血型系统，MNS血型系统，P血型系统 ，Rh血型系统，Lutheran血型系统，Kell血型系统，Lewis血型系统， Duffy血型系统，Kidd血型系统， Hh/孟买血型系等，这些系统都独立遗传存在，控制所有血型系统遗传的遗传基因位于同一染色体上[3]。其中在临床中最重要的血型系统为ABO系统和Rh系统，ABO系统同样具有多种表型和亚型，ABO遗传基因位于9q34.1-9q34． 2位点，同源性极高，仅有单个碱基或几个碱基替换，为高度保守的核苷酸序列，其分子基础为高度同源的糖原在半乳糖转移酶的作用下与H前体的半乳糖相连所形成。有研究表明血清学ABO亚型的鉴定具有一定的不可靠性,我国目前ABO系统亚型多有报道，但这些报告往往缺乏核苷酸突变的实验结果，并且血清学检测受单克隆抗体的不同、实验所选择的试剂特异性差别、抗原基因改变、各实验室检测条件的不同、甚至操作者操作不同的影响[4,5]，笔者建议对这些抗原抗体不规则反应的血液标本应进一步进行基因定型检测，以实验结果作为亚型诊断的可靠依据，对实验资质较差的单位应将此类血液样本送往区域或国家级别的参比实验室进行进一步的确认，以防误诊，这是因为抗-A、抗-B及抗-AB抗体天然就在人体血清内存在，因此哪怕只输入仅仅几毫升的血型不相配血液就能引起严重的溶血反应甚至引起患者死亡的严重后果[6]。因此在临床实践中，确定ABO血型定型至关重要，本研究采用稳定的PCR-SSP法，操作简便快捷，且对ABO血型亚型鉴定准确，可排除因自身抗体或不规则抗体导致的误差也能排除由于白血病、骨髓异常增生综合征等肿瘤导致的ABO血型亚型改变，也不受细菌和血红蛋白紊乱等原因造成的假凝集现象的干扰，对标本要求低不局限于血液，所有有核细胞均可作为实验样本包括皮肤毛囊、血迹血痕、羊水、组织块、精斑等均可作为样本经过PCR扩增取得合格的实验结果，同时PCR-SSP技术的标本易于取材、保存和运输，在不同的实验室用进行的实验其结果具有可比性，能弥补常规血清学检测的不足，区别于常规血清学检测只能鉴定血液样本的表型，PCR-SSP技术能准确鉴定血型亚型及杂合子与纯合子，对于难以鉴定的亚型和产前胎儿血型诊断等具有重要意义，其对取材的广泛性也使之能在法医鉴定、遗传鉴定等领悟内发挥作用[7,8]。

本研究结果表明[9,10]，经过血清学检测9例临床病人血清学表型为：AxB 2例、AB亚1例、A亚B亚1例，Ax 2例，B亚3例，使用实验室稳定的PCR-SSP技术检测9例患者基因型分别为为：A/B 4例，A/O 2例，B/O 3例，通过PCR-SSP检测所得基因型与血清学表型结果完全一致。

参考文献：

[1]毛征宇,万本愿,王文丁,等.PCR-SSP与血清学技术用于ABO血型分型的比较[J].国际检验医学杂志,2012,33(12):1425.

[2]曾学平,王恭,陆理,等.ABO血型A201等位基因表达A抗原活性的分析[J].临床和实验医学杂志,2014,4(23):2000.

[3]李俊勋,詹洁瑜,张帆,等.PCR-SSP对潜在输血需要住院患者ABO基因分型的检测效果与意义[J].中山大学学报(医学科学版),2013,34(5):786.

[4]赵志弘,乔芳,石翠英,等.ABO基因定型解决正反定型不符合标本3例[J].临床输血与检验,2012,14(1):14.

[5]肖莉,后平钦,李国良,等.PCR-SSP法在ABO疑难血型鉴定中的应用[J].实验与检验医学,2013,31(5):444.

[6]刘衍春,刘毅,赵卫军,等.a-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因EXON 7突变形成A311血型基因亚型[J].中国实验血液学杂志,2014,22(3):821.

[7]吕杭军,洪小珍,应燕玲,等.ABO血型新等位基因Ael08的分子生物学研究[J].中国输血杂志,2011,5(8):676.

[8]梁伟,周建霖,杨亮,等.PCR-SSP技术在红细胞ABO血型快速基因分型中的应用研究[J].中华全科医学,2015,13(8):1323.

[9]刘衍春,马玲,郑凌,等.疑难ABO血型标本的血清学与基因测序分析[J].江苏医药,2015,2(8):901.

[10]黄文华,卓孝福,林海娟,等.福州地区汉族人群ABO血型系统基因型研究[J].国际输血及血液学杂志,2014,37(1):16.

文章编号：1007-4287(2016)07-1113-03

中图分类号：R446.11

文献标识码：A

(收稿日期：2015-04-28)

Difficulty of ABO blood group specimen phenotype and gene detection

WANGYing.

(TheHospitalAffiliatedtoLiaoningUniversityofTCM,Shenyang110032,China)

Abstract:ObjectiveTo study the analysis of difficult specimens of ABO blood group and its allele detection,for clinical encounter difficulty provide reliable blood specimens of ABO blood group identification method.MethodsSelected during August 2013 to August 2014 working in the hospital each department makes clinical patient blood samples from 9 cases,first of all,according to the conventional blood detection techniques for ABO serological test,determine ABO positive and negative stereotypes,again using guanidine hydrochloride/proteinase K cracking after extraction of ETDA anticoagulant treatment of peripheral vein for DNA extraction,then using the method of polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR SSP) ABO blood group 9 cases of blood sample genotyping detection.Results9 cases of clinical serological phenotype for patients:AxB in 2 cases,AB,and 1 case,and A and B,and 1 case,Ax in 2 cases,B,and 3 cases,9 cases of patients with genotype,respectively is:A/B 4 cases,2 cases of A/O,B/O 3 cases,measured by PCR - SSP genotype is consistent with the results of serological phenotype.ConclusionUsing the method of polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR SSP) ABO blood group identification results of serological method for positive and negative don't finalize the design difficulty of blood specimens tested genotypes,to accurately determine the patient's blood group antigen,for clinical patients with complicated ABO blood group provide guarantee for safe and effective blood scheme.

Key words:difficult specimens of ABO blood group;Allele.The method of polymerase chain reaction sequence specific primers