张耀月，胡锡阶，祁 莹，赵佩翔，万 雪，万卫红，张 昊，刘祖林，余丽梅

(1.遵义医科大学附属医院 贵州省细胞工程重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学 法医学院，贵州 遵义 563099； 3.遵义医科大学附属医院 检验科，贵州 遵义 563099)

唐氏综合征(Down’s syndrome,DS)又称21-三体综合征，为临床常见的染色体数目异常疾病，以智力低下、特殊面容及心血管等多脏器畸形和功能异常为主要临床表现，易导致流产、死胎，新生儿发病率约1/800～1/600[1]。目前，DS尚无有效的治疗方法，及早发现，阻滞DS患儿出生，是主要的预防措施。血清学产前筛查、超声检查、无创产前胎儿游离DNA基因检测及羊水细胞染色体核型分析分别为临床筛查和确诊的依据，出生后根据患儿临床表型，外周血染色体核型分析为确诊金标准[2-4]。后两种方法准确性高、特异性好，但存在着技术难度高、操作复杂、检测周期长的突出问题，仍需继续优化检测方法。

短串联重复序列(Short tandem repeat,STR)分型技术广泛应用于法庭科学和群体遗传学研究，具有检测简单快速，灵敏度高、准确性和重复性好、信息含量高及结果可靠等优点[5]。以往的案例报道中，采用Identifiler、PowerPlex、Goldeneye 20A试剂盒经STR分型及多重荧光PCR检测，发现了不同染色体三峰型(三带型)三等位基因和其他染色体病[6-11]。本研究与染色体核型分析互为验证，采用符合中国人群基因座遗传多态性特征的Goldeneye 20A试剂盒，与正常人比较，全面分析94例DS患者21号染色体所含D21S11与新增Penta D基因座峰型、峰高和峰面积等特征，以明确该试剂盒两个基因座联合在快速检测DS中可能的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 94例DS患者(男性50例，女性44例)血样收集于2016～2019年遵义医科大学附属医院检验科细胞遗传室，经染色体核型分析确诊DS，剩余血样用于基因组DNA提取。正常人血样来自2017～2018年遵义医科大学附属医院贵州省细胞工程重点实验室/司法鉴定中心法医物证室日常亲子鉴定检案和检验科细胞遗传室染色体核型正常者，随机选取100例(男性65例，女性35例)无关个体血样。

1.2 仪器与试剂 美国ABI公司2720 Thermal cycler PCR扩增仪、3500-DX遗传分析仪和GeneMapper ID-X 1.4软件，QIAamp® blood mini DNA试剂盒(Qiagen公司，德国)，晶芯NanoQ微型分光光度计(北京博奥晶典生物技术有限公司，中国)，Goldeneye 20A PCR扩增试剂盒为基点认知公司(北京)有限公司产品(中国)，GSL120高通量全自动染色体扫描平台(Leica公司,德国)，CX41倒置相差显微镜(Olympus，日本)，植物血凝素和秋水仙素分别购于上海伊华医学科技有限公司和美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 G显带染色体核型分析 DS患者抗凝外周静脉血细胞培养72 h，20 μL秋水仙素处理1小时后，收集细胞沉淀，按照G显带技术要求，37 ℃，经0.075 mol /L氯化钾低渗，3:1甲醇/冰醋酸固定、制片，显微镜下观察30个中期分裂相，用全自动染色体扫描平台和CytoVision.lnk软件采集、分析染色体核型，确诊DS。

1.3.2 DNA提取与定量 DS患者血样使用QIAamp® blood mini DNA 试剂盒提取DNA，NanoQ微型分光光度计测定DNA浓度，样本DNA浓度稀释至0.35 ng/μL；正常人EDTA抗凝静脉血80 μL制成FTA血卡，手动打孔取1.0 mm2血斑加于EP管。

1.3.3 PCR扩增与毛细管电泳 按Goldeneye 20A试剂盒说明书要求，对样本DNA进行复合PCR扩增。扩增条件：95℃，5 min，94℃，30 s，60℃，60 s，70℃，60 s，27个循环，阴性对照(water)、阳性对照(9947A)和样本同一批次扩增。取1.2 μL扩增产物在3500-DX遗传分析仪进行毛细管电泳，GeneMapper ID-X 1.4软件分析STR分型图谱，并自动计算等位基因荧光峰峰高、峰面积。Goldeneye 20A试剂盒等位基因分型标准物分型图谱，D21S11基因座可见25种等位基因座，Penta D基因座存在15种等位基因座，阴性对照无荧光峰，阳性对照STR分型峰均衡，均符合质控要求。

1.4 统计学处理 SPSS 18.0软件计算D21S11和Penta D基因座等位基因峰高比值、峰面积比值和等位基因频率；两组间等位基因频率比较采用卡方检验，两组间样本均数比较采用t检验，P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 染色体核型 正常人外周血细胞染色体核型分析可见23对(46条)染色体，未见明显染色体数目和结构异常(见图1A)。94例确诊为DS患者的均显示21号染色体出现了典型的三条染色单体(见图1B)，其余22对染色体未见明显异常。

图1 正常人(A)与DS患者(B,红色箭头所示)外周血细胞G显带染色体核型分析结果

2.2 正常人STR分型 参照欧洲临床细胞遗传学分子遗传学会《QF-PCR诊断非整倍体最佳操作指南》对常染色体STR峰型特征的描述[12-13]：峰面积比值在0.8～1.4间的两个峰为正常二倍体(重复序列长度>24bp的等位基因，该比值可高至1.5)，比值<0.65或>1.8失衡的两个峰，或者出现1个峰，且峰面积是相邻杂合子单峰峰面积3倍时，判定为三等位基因。比值介于中间范围0.65～0.8和1.4～1.8的非结论性结果，可以通过使用单标记物重新检测来解决，本研究则采用21号染色体上D21S11和PentaD两个基因座联合分析，与重复检测确定。

100例正常人的STR分型结果中，D21S11检出11种等位基因，Penta D检出8种等位基因。96例D21S11和Penta D基因座检出的纯合子单峰型等位基因和杂合子双峰型等位基因中均未见三等位基因(见图2)，另有4例D21S11双峰型等位基因峰面积比值虽然介于0.68～0.78之间，但Penta D单、双峰型等位基因的峰高比值、峰面积比值均在正常范围，重复检测后比值均在正常范围。

A、B：D21S11S和Penta D基因座双峰型等位基因；C、D：D21S11S和Penta D基因座单峰型等位基因。图2 正常人D21S11S和Penta D基因座STR分型图谱(红色箭头所示)

2.3 DS患者D21S11和Penta D三峰型三等位基因图谱 94例DS患者的STR分型图谱中，D21S11共检出13种等位基因，Penta D基因座检出9种等位基因。21号染色体三峰型三等位基因存在3种情况：(1)两个基因座同时为三峰型三等位基因16例(见图3A)；(2)D21S11基因座为三峰型三等位基因29例，其中含Penta D双峰型三等位基因25例(见图3B)，单峰型三等位基因4例(见图3C)；(3)Penta D基因座为三峰型三等位基因18例，其中含D21S11双峰型三等位基因15例(见图3D)，3例为单峰型三等位基因(见图3E)。

A：D21S11和Penta D均为三峰型等位基因；B： D21S11为三峰型等位基因，且Penta D为双峰型等位基因；C：D21S11为三峰型等位基因，且Penta D为单峰型等位基因；D：Penta D为三峰型等位基因，且D21S11为双峰型等位基因；E：Penta D为三峰型等位基因，且D21S11为单峰型等位基因。图3 DS患者D21S11和Penta D基因座STR分型三峰型图谱(红色箭头所示)

2.4 DS患者D21S11和Penta D双峰型三等位基因图谱 94例DS患者中，D21S11和Penta D同时为双峰型三等位基因16例(见图4A)，D21S11为双峰型三等位基因及Penta D为单峰三等位基因者5例(见图4B)，7例Penta D为双峰型三等位基因及相应D21S11为单峰三等位基因(见图4C)，仍有2例D21S11和Penta D两次检测峰高、峰面积比值均不符合三等位基因判断标准，他们的峰高比值/峰面积比值分别为0.87/0.85、0.97、0.97，且前一例还存在TPOX的单峰型三等位基因。另见1例Penta D和D21S11均为纯合子单峰型三等位基因(见图4D)。

本研究中所有DS患者1、2、13、18等其他17个常染色体STR基因座均与正常人的峰型、峰高和峰面积相似，未见三等位基因。

A:D21S11和Penta D均为双峰型等位基因；B:D21S11为双峰型等位基因，同时Penta D为单峰型等位基因; C:D21S11为单峰型等位基因，同时Penta D为双峰型等位基因；D:D21S11和Penta D基因座同为单峰型等位基因。图4 DS患者D21S11和Penta D基因座STR分型双峰型图谱

2.5 DS患者D21S11和Penta D双峰型等位基因峰高比值与峰面积比值 D21S11、Penta D基因座除外三峰型三等位基因和重复检测双峰型峰高比值和峰面积比值仍然>0.8者，D21S11、Penta D双峰型等位基因者分别为21和23例，除2例D21S11双峰峰高比值/峰面积比值为0.66/0.66、0.75/0.75，相应Penta D为双峰型三等位基因，1例Penta D双峰峰高比值/峰面积比值为0.81/0.77，相应D21S11为双峰型三等位基因，其余患者D21S11和Penta D双峰型等位基因峰高比值/峰面积比值均介于0.34～0.64之间。正常人的双峰型等位基因的峰高比值/峰面积比值均介于0.8～1.0之间，在这些双峰型等位基因中，DS患者D2S11和Penta基因座的峰高比值、峰面积比值都小于正常人。

表1 DS患者D21S11和Penta D基因座双峰型等位基因峰高、峰面积比值

与正常人比较，*：P<0.01。

2.6 DS患者D21S11和Penta D基因座等位基因频率比较 DS患者和正常人D21S11基因座均为30、29等位基因频率最高，30.2较低，DS患者各等位基因频率与正常人无明显差异(P>0.05，表2)。DS患者和正常人Penta D基因座均为9等位基因频率最高，分别为15、7等位基因频率最低，两组人群中等位基因频率没有明显差异(P>0.05，表3)。上述等位基因均在阳性质控中可见。

表2 DS患者和正常人D21S11基因座等位基因频率分布的比较

表3 DS患者和正常人 Penta D基因座等位基因频率分布的比较

3 讨论

DS的染色体病变最主要是由于卵细胞形成的减数分裂Ⅰ期21号染色体不分离造成，也可能在减数分裂Ⅱ期21号染色体不分离，或少数涉及精子减数分裂不分离、易位或嵌合等[14-15]，≥35岁高龄孕妇胎儿DS患病风险增高3～5倍，严重影响人口素质，给患儿、家庭及社会带来沉重的经济和精神负担。在出生缺陷的二级预防和出生后的分子遗传学检测中，除孕妇外周血胎儿游离DNA高通量测序外，研究者们采用多重荧光PCR、STR分型等技术，不断探索检测羊水及出生后脐带血和外周血细胞21号染色体S100B、SOD1等特定基因和分析D21S11基因座等三峰型三等位基因[7,10,14]，在保证特异性前提下，提高DS检测的准确性，一直是实现快速筛查或诊断的关键。

常染色体STR基因座的遗传多态性和呈孟德尔方式遗传，是STR分型检测被应用于群体遗传学研究及法庭科学的重要基础。正常情况下，1个STR基因座上只有 2个等位基因，其分型图谱显示为正常的纯合子单峰型或杂合子双峰型荧光峰。研究报道，针对D21S11、D21S1442、D21S2039和 D21S1809 等STR位点，联合检测DS，2、4和6个基因座联合，对于标准型DS检出率可达到83%、92%和99.5%[15-18]，表明联合多个高遗传多态性的STR位点可提高诊断的准确性。Goldeneye 20A试剂盒即在核心序列D21S11基础上，增加了在中国人群中遗传多态性良好的Penta D基因座，前者是位于21q21.1的TCTA TCTG复杂重复序列，后者是位于21q22.3的AAAGA核心重复序列。该试剂盒的法庭科学应用，系统效能良好，中国人群中19个常染色体STR基因座也具有理想的杂合度、等位基因数和个体识别力[11]，也在检案中已陆续发现TPOX基因座、D21S11和Penta D基因座均显示1∶1∶1三峰型三等位基因[19-21]。

100例正常人未检出三等位基因的结果不但有利于进一步的峰面积、峰高比值分析，也表明了联合D21S11和Penta D基因座检测DS的高特异性。对94例经染色体核型分析确诊DS患者的STR分型图谱的全面分析中，按照欧洲有关三等位基因峰面积判断标准，本研究联合应用21号染色体上的两个不同位置的D21S11或Penta D基因座同时分析，结果显示，Penta D与D21S11基因座相似，三带型三等位基因以峰高比均衡约1∶1∶1者为主，分别占88.2%(30/34)和84.4%(38/45)；但也发现了与大多数文献报道不尽相同的STR图谱特征，即存在6种三峰型、双峰型和单峰型三等位基因：(1)两个基因座均为三峰型；(2)1个基因座为三峰型加另1个基因座为双峰型；(3)1个基因座为三峰型加另1个基因座为单峰型；(4)两个基因座均为双峰型；(5)1个基因座为双峰型加另1个基因座为单峰型；(6)两个基因座均为单峰型。因此，单独依据D21S11或Penta D三峰型三等位基因的DS阳性检出率仅为47.87%(45/94例)、36.17%(34/94例)；两个基因座中任一者呈现三峰型三等位基因即满足结果判断，DS阳性检出率则可达67.02%(63/94例)，与仅检测D21S11基因座发现DS的研究比较，明显提高了DS阳性检出率。在非三峰型三等位基因的DS患者中，除1例D21S11或Penta D基因座均为单峰型三等位基因的DS图谱外，单独依据D21S11或Penta D基因座为双峰型三等位基因的DS阳性检出率分别为22.34%(21/94例)和24.47%(23/94例)；两个基因座中任一者呈现双峰型三等位基因即满足结果判断，DS阳性检出率可达29.79%(28/94例)，意味着DS的总漏检率降低了29.79%。

联合应用D21S11、Penta D基因座的多种三峰型和双峰型及单峰型三等位基因特征与峰高、峰面积分析，总计DS阳性检出率可高达97.87%(92例/94例)，较仅采用D21S11基因座三峰和双峰型而言，增加Penta D和单峰型三等位基因后将DS阳性检出率显著提高了26.67%，大大降低了单基因和易被忽略的单峰型DS者的漏检。对于8例双峰型基因座峰高、峰面积比值介于0.65～0.8之间的DS患者，重复检测后仍有2例Penta D和D21S11基因座峰高、峰面积均>0.8，不符合三等位基因判断标准，表明采用Goldeneye 20A试剂盒中Penta D和D21S11两个基因座联合检测分析，仍然存在2.13%的漏检率，也提示这2例致病机制显然不是标准型21号染色体减数分裂I期不分离所致，其中1例存在复合染色体病变，伴有2号染色体TPOX基因座的三等位基因。TPOX是甲状腺过氧化物酶基因内的一个多态性适中、突变率低，可稳定遗传的STR基因座，在序列图的位置为1483854-1484085(bp)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，核心序列为AATC，在中国人群中存在4-15的不同等位基因，TPOX基因座是以往研究中发现最多的三峰型三等位基因之一[19,22]。上述结果若结合父母的STR分型结果，还可判读染色体不分离的来源。然而，DS患者D21S11和Penta D基因座等位基因频率与正常人没有明显差异，与众多研究所述等位基因频率的差异受种族、地域等因素影响更为明显，而DS在等位基因变化上可能存在较大的随机性。

总之，采用Goldeneye 20A试剂盒中Penta D和D21S11两个基因座联合检测DS，对STR分型图谱6种三峰型、双峰型和单峰型特征及峰高、峰面积比值全面的分析，使DS检出的准确性大大提高，而且与染色体核型分析相比，STR基因座分型技术仅需要6 h左右，即可完成样本检测及数据分析，不但方法简便、快速高效，且检测所需样本量较少，成本较低等优点，更适于临床快速检测，尤其是进行胎儿羊水细胞、新生儿血片筛查或脐带血筛查等都可能对具有较好的应用价值。