钱　琤,司　宇,徐贵霞,叶　辛,谷明莉,任传路,吴天勤*,邓安梅*

(1.解放军第100医院，江苏 苏州215007；2.第二军医大学附属长海医院，上海200433)



原发性免疫性血小板减少症患者外周血IL-23p19基因表达及意义

钱琤1,司宇2,徐贵霞2,叶辛2,谷明莉2,任传路1,吴天勤1*,邓安梅2*

(1.解放军第100医院，江苏 苏州215007；2.第二军医大学附属长海医院，上海200433)

摘要：目的研究IL-23p19在原发性免疫性血小板减少症(Primary immune thrombocytopenia，ITP)患者外周血单个核细胞中的表达及意义。方法采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了55例ITP和35例健康对照外周血单个核细胞(PBMC)中IL-23p19基因表达量，分析ITP患者IL-23p19基因表达与疾病分期、血小板数及细胞因子的相关性。结果ITP患者外周血PBMC 中IL-23p19基因表达较健康对照明显增高，且慢性ITP和难治性ITP IL-23p19基因表达均高于新诊断期，难治性ITP高于持续性ITP；ITP患者IL-23p19表达与PLT呈负相关，与IL-17水平呈正相关，与IFN-γ、IL-4、IL-10无相关性。结论IL-23p19基因在ITP中表达升高，IL-23表达异常与ITP发病密切相关。

关键词：原发性免疫性血小板减少症；白介素23 p19；自身免疫性疾病

(ChinJLabDiagn,2016,20:1068)

原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一种以血小板减少为特点的获得性自身免疫性疾病，以出血为主要临床表现。其经典机制认为是由于自身抗体致敏的血小板被单核-巨噬细胞系统过度破坏所致。近年来研究发现，除体液免疫外，细胞免疫在ITP的发病中亦起着重要作用。ITP患者出现Th1细胞极化，Th17细胞增加，某些相关的细胞免疫效应分子的表达也出现异常[1]。

IL-23作为IL-12 细胞因子家族的新成员，由IL-23p19 和 IL12p40 组成异源二聚体分子。IL-23具有十分复杂的生物学功能，在抗感染免疫、抗肿瘤免疫以及自身免疫病的发病中发挥着重要的作用[2]。本研究用实时荧光定量PCR方法检测ITP患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)IL-23p19基因的表达情况，并分析在疾病不同时期IL-23p19表达情况与血小板计数及细胞因子表达的相关性，以期为临床诊断及治疗提供新的线索。

1对象与方法

1.1对象2013年-2014年间在我院就诊ITP 患者共55例，其中男性25例，女性30例，平均年龄35岁(16-60)岁，包括16例新诊断的ITP、12例持续性ITP、20例慢性ITP、7例难治性ITP患者，诊断标准参照成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识(修订版)[3]。35例正常体检志愿者为健康对照组。本研究经过伦理委员会批准，所有受试对象均签署知情同意书。

1.2血样标本的采集与PBMC的分离采集空腹静脉血5 ml，置于枸橼酸钠抗凝剂的无菌试管中。采用密度梯度离心法分离PBMC(sigma)。

1.3RNA抽提与反转录采用Trizol法抽提细胞总RNA，将其反转录为cDNA，-20℃冰箱备用。细胞总RNA 抽提试剂盒Invitrogen公司及逆转录试剂盒Applied Biosystems公司。

1.4定量PCR采用Taqman探针技术以18s rRNA 为内参将逆转录得到的cDNA模板进行PCR扩增。IL-23p19引物序列为：上游5′- CAGCTTCATGCCTCCCTACTG -3′下游5′AGGCTTGGAATCTGCTGAGTCT-3’, 探针FAM-AACTCCTGCAGCCTGA-MGB；内参18s RNA 上游5′- ACATCCAAGGAAGGCAGCAG -3′;下游5′-TTCGTCACTACCTCCCCGG-3′;FAM-CGCGCAAATTACCCACTCCCGA-TAMRA。 PCR反应条件为：50℃ 2 min,95℃ 10 min随后95℃ 15 S，60℃ 1 min循环45次。读取每个定量PCR反应的阈循环(CT)值后，将定量PCR结果以2-ΔΔCT表示。ΔΔCT =[ΔCT (患者) ]-[ΔCT(对照) ],ΔCT = [CT(靶基因)]-[CT(管家基因)] 。

1.5临床实验室指标的检测采用Sysmex XN-1000全血细胞计数仪测定血小板(PLT)计数。

1.6血清细胞因子的检测IL-17、IFN-γ、IL-4、IL-10和浓度测定根据ELISA试剂盒操作说明进行测定。

1.7统计学处理采用graphpad prism5.0统计软件进行统计学分析,两组之间比较采用Student’s t检验，多组资料的比较采用方差分析检验，相关性分析采用Pearson法，以P<0．05为差异有统计学意义。

2结果

2.1ITP患者PBMC中IL-23p19表达

结果显示，与正常对照组相比，ITP患者中PBMC IL-23 p19 mRNA表达量显著增高(fold= 8.32，t=13.36，P<0.0001)， 差异有统计学意义，见图1A。

2.2ITP患者PBMC中IL-23p19mRNA分期表达结果

不同分期的ITP患者IL-23p19基因表达有差异(P<0.05)，相对表达量分别为新诊断6.50±2.60 ；持续性7.033±2.54；慢性9.58±2.86；难治性11.11±3.56，见图1B。与新诊断ITP相比，慢性ITP和难治性ITP IL-23p19基因表达均升高(新诊断ITP vs 慢性ITP，q=4.616，P<0.05) 新诊断ITP vs 难治性ITP，q=5.120，P<0.01)；与持续性ITP相比，难治性ITP表达升高(q=4.319，P<0.05)。

A． ITP与正常健康对照组IL-23mRNA表达 *P<0.001与健康对照比较；B． ITP不同分期IL-23mRNA表达 *P<0.05，与新诊断ITP比较；**P<0.05，与持续性ITP比较

图1不同组别外周血单个核细胞IL-23mRNA表达

2.3ITP患者外周血PBMC中IL-23p19表达与PLT及细胞因子的相关性分析

ITP患者PBMC 中IL-23p19与PLT呈负相关(r=-0.4070，P<0.01)，见图2A；与血清IL-17呈正相关(r=0.446 3，P<0.01)，见图2B，IL-23p19 mRNA的表达量与IFN-γ、IL-4、IL-10等不相关。

A IL-23p19mRNA表达与血小板计数的相关性分析B IL-23p19mRNA表达与的血清IL-17表达相关性分析

3讨论

ITP是一种常见的出血性自身免疫性疾病，以血清中出现抗血小板抗体为特征，临床上出现由于免疫功能异常紊乱导致的出血症状。近年研究表明，细胞免疫功能异常在疾病致病过程中发挥重要作用，包括B细胞、 T细胞、树突状细胞免疫功能异常，而其中T细胞介导的免疫反应在ITP的发病过程中起到至关重要的作用[4]。

IL-23是异二聚体分子，除了与IL-12共用一个亚基p40外，自己还有独特的亚基IL-23p19。内皮细胞和 B细胞、T细胞、MΦ和DC都能表达p19 mRNA[5]。尽管IL-23与IL12的结构类似，但功能并不完全相同，IL-12主要是促使Th0向Th1分化，而IL-23主要作用于记忆T细胞，促进其分化。研究发现在自身免疫性疾病模型EAE和RA中IL12 促进了幼稚T细胞的分化，而IL-23是在最后阶段介导炎症反应的关键效应因子[6]。IL-23表达增多参与多种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎[7]、多发性硬化[8]、炎症性肠病[9]等。本研究检测了ITP 患者及健康对照组外周血PBMC IL-23p19mRNA的表达，结果发现与正常对照组相比，ITP患者PBMC中IL-23 p19mRNA表达量显著增高，差异有统计学意义，说明IL-23p19的表达增高与ITP的发病密切相关。我们进一步研究了不同疾病分期IL-23p19mRNA的表达，发现慢性期和难治性表达均高于新诊断期，难治性ITP高于持续性ITP，表明IL-23p19 mRNA表达水平在疾病早期低表达，随着疾病的进一步发展，进入到疾病后期明显升高，分析原因可能是由于ITP后期以炎症反应为主，高表达的IL-23p19主要在疾病的后期促炎症反应中发挥效应。

患者外周血PLT计数，可以在一定程度上反映出ITP的严重程度和疾病的进展状况，本研究发现IL-23p19基因表达与PLT计数呈负相关，表明IL-23p19可以成为评价疾病严重程度的潜在指标之一。本研究还发现，IL-23p19与IL-17表达具有相关性，这可能是由于IL-23通过与IL-23R结合，促进IL-23R细胞内酪氨酸残基磷酸化，导致STAT3磷酸化，进入细胞核，促进T细胞活化为Th17细胞，从而释放IL-17，导致血清IL-17表达增高。

本实验建立了IL-23p19基因表达的实时荧光定量RT-PCR方法，首次从分子水平证实了IL-23p19基因在ITP患者中的表达增高，提示IL-23p19与ITP的发生发展存在一定相关性，IL-23p19基因表达为ITP的临床诊断及治疗提供了新的思路。

参考文献：

[1]Kistangari G, McCrae KR. Immune thrombocytopenia[J].Hematol Oncol Clin North Am,2013,27(3):495.

[2]Lankford CSI,Frucht DM.A unique role for IL-23 in promoting cellular immunity[J].J Leukoc Biol,2003,73:49.

[3]中华医学会血液学分会血栓与止血学组．成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识(修订版)[J]．中华血液学杂志, 2011，32(3)：214．

[4]Semple JW, Provan D.The immunopathogenesis of immune thrombocytopenia:T cells still take center-stage[J].Curr Opin Hematol,2012,19:357.

[5]Duvallet E, Semerano L, Assier E, et al. Interleukin-23:a key cytokine in inflammatory diseases[J].Ann Med,2011,43(7):503.

[6]Cua DJ, Sherlock J, Chen Y,et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain[J].Nature,2003,421(6924):744.

[7]Abu Al Fadl EM,Fattouh M, Allam AA.High IL-23 level is a marker of disease activity in rheumatoid arthritis[J].Egypt J Immunol,2013,20(2):85.

[8]Li Y,Chu N,Hu A,et al.Increased IL-23p19 expression in multiple sclerosis lesions and its induction in microglia[J].Brain,2007,130(Pt 2):490.

[9]Fransen K, van Sommeren S, Westra HJ,et al.Correlation of genetic risk and messenger RNA expression in a Th17/IL-23 pathway analysis in inflammatory bowel disease[J].Inflamm Bowel Dis,2014,20(5):777.

基金项目：国家重点基础研究发展计划(973)项目(2013CB531606)；国家自然科学基金(81471605，81401358)；南京军区重点基金项目(15ZD009)；南京军区面上项目(14MS026)

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)07-1068-04

中图分类号：Q786

文献标识码：A

作者简介：钱琤(1978-)，女，医学博士，主治医师，主要从事自身免疫病及机制研究。司宇(1990-)，女，在读研究生，主要从事自身免疫病研究，为共同第一作者。

(收稿日期：2015-03-26)

Expression of IL-23p19 in perpheral blood of patients with primary immune thrombocytopenia

QIANCheng1,SIYu2,XUGui-xia2,etal.

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,No.100HospitalofPLA,JiangsuSuzhou215007,China;2.LaboratoryDiagnostics,ShanghaiChanghaiHospital,Shanghai200433,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of IL-23p19 in perpheral blood of patients with primary immune thrombocytopenia (ITP) and its clinical significance.MethodsThe real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR) was used to determine the expression of IL-23p19 mRNA in the peripheral blood of 55 ITP patients and 35 healthy controls . The correlations between the expression of IL-23p19mRNA and the staging,platelet counts,serum cytokine concentrations of ITP patients were analyzed statistically.ResultsThe IL-23p19 mRNA level in PBMC of ITP was significantly higher than those in healty controls. Afterwards, higher levels of IL-23mRNA were found in patients with chronic ITP and refractory ITP than in patients with newly diagnosed ITP. Compared to persistent ITP, refractory ITP patients had increased IL-23p19mRNA levels.The IL-23p19 mRNA level in ITP patients were negatively correlated with the platelet counts, positively correlated with IL-17 in ITP patients,and there was no association with IFN-γ, IL-4 and IL-10. ConclusionThe IL-23p19 gene expression of PBMC in ITP patients is significantly elevated, indicating that IL-23 play an important role in the pathogenesis of ITP.

Key words:primary immune thrombocytopenia，refractory;IL-23p19;Autoimmue diseases