马倩倩，吴翠云，2，*，蒲小秋，王 德，孙亚强（.塔里木大学植物科学学院，新疆生产建设兵团南疆特色果树生产工程实验室，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）



高效液相色谱法同时测定枣果实中的有机酸和VC含量

马倩倩1，吴翠云1，2，*，蒲小秋1，王 德1，孙亚强1
（1.塔里木大学植物科学学院，新疆生产建设兵团南疆特色果树生产工程实验室，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

目的：建立枣果实中有机酸含量的高效液相色谱测定方法。方法：采用高效液相色谱-二极管阵列检测器法，水浴超声、离心、膜过滤提取枣果实中的有机酸。色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.04 mol/mL KH2PO4溶液，流速0.5 mL/min，柱温30 ℃，检测波长210 nm。结果：在此色谱条件下，草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸和VC在30 min之内得到基线分离。7 种有机酸和VC标准曲线的相关系数（R2）均在0.998 9以上；精密度检测，相对标准偏差为0.98%～4.77%（n=5）；重复性检测，相对标准偏差为0.88%～2.19%（n=5）；回收率在91.35%～105.74%之间。结论：本方法准确、高效、便捷，适于枣果实中有机酸的测定。

高效液相色谱法；枣；有机酸；VC

酸枣（Ziziphus jujuba var.spinosa）和枣（Ziziphus jujuba Mill.）均为鼠李科枣属植物，枣果实中含有丰富的黄酮类、五环三萜类、环磷酸腺苷、VC、膳食纤维、精油、醇溶性物质等，不仅营养丰富而且具有很高的药用和食疗价值［1］。其果实除鲜食味美外，还可干制，研制糖果、饮料、冷饮、果酒、果脯等产品［2］。枣果实具有安神、镇静、健脑、补血、增强免疫力、抗癌等功效。在新疆独特的气温与光照条件下枣果实的营养物质含量均高于其原产地［3］。而有机酸和VC作为果实风味和营养物质的重要构成因素，起到了调节风味和增加营养的功效。因此研究枣果实中的有机酸和VC对于枣产品的开发和利用具有重要意义。

有机酸的测定通常采用滴定法［4］、分光光度法［5］、气相色谱-质谱联用法［6］、离子色谱法［7］、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法［8］等。目前，HPLC法对有机酸和VC的测定已经成功应用到葡萄［9］、南瓜［10］、沙棘［11］、蓝莓［12］、蜜桃［13］、人参果［14］、柑橘［15］、李［16］、山楂［17］、菠萝蜜［18］等果实中。周晓明等［9］采用HPLC法对新疆40 个有核和20 个无核葡萄品种中的酒石酸、柠檬酸和苹果酸进行了定量分析；夏春华等［18］发现菠萝蜜果肉中的有机酸主要为柠檬酸和苹果酸，不同株系间有机酸含量和组分差异显著；杨巍等［19］对不同前处理后‘澳洲青苹’苹果果实中有机酸组成和含量的变化进行了分析，得出在常温（25 ℃）条件下超声振荡提取15min为宜；孙延芳等［20］利用HPLC法检测出了陕北地区酸枣干果、鲜果和果酱中有机酸和VC的含量；李卫红等［21］利用HPLC法测定出了冬枣中6 种有机酸的含量；Rodrigo等［22］对水果果汁中苹果酸、酒石酸和VC进行了检测分析。但目前关于枣果实中有机酸和VC含量测定的报道较少，测定方法和条件也不尽相同，不利于研究者对文献进行对比分析。本实验旨在建立一种更加方便、快捷的针对枣果实中的有机酸和VC同步测定的HPLC法，同时对南疆地区骏枣和0604酸枣果实中主要有机酸和VC进行定量分析，期待为枣果实内在品质的科学评价和枣产品的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用材料为塔里木大学园艺实验站枣种质资源圃中的骏枣和0604酸枣。

草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸、VC标准品 中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯） 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；纯净水 娃哈哈集团有限公司。

1.2 仪器与设备

1260 HPLC仪（配有G1311C型四元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G4212B二极管阵列检测器、OpenLAB CDS色谱工作站） 美国Agilent公司；Inertsil ODS-3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 日本GL Sciences公司；FA1104N电子分析天平 上海菁海仪器有限公司；KQ5200E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Multifuge X1R高速冷冻离心机 德国Heraeus公司；雷磁PHSJ-4F实验室pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

Inertsil ODS-3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相0.04 mol/mL pH 2.4的KH2PO4-H3PO4缓冲溶液；流速0.5 mL/min；柱温30 ℃；检测波长210 nm；进样量10 μL。

1.3.2 有机酸对照品溶液制备

分别精密称取适量酒石酸、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、草酸、富马酸、琥珀酸、VC，加入纯净水分别制成酒石酸、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、草酸、富马酸、琥珀酸、VC的10 mg/mL对照品储备液。

1.3.3 混合对照品溶液的制备

分别精密吸取适量上述对照品储备液，加水制成草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸和VC分别为0.1、1、1、1、1、0.1、0.5、0.3 mg/mL的混合对照品溶液，过0.22 μm微孔滤膜待测。

1.3.4 样品处理

参照张丽丽［23］、郭燕［24］等方法并有所改进，准确称取1 g果肉加入0.04 mol/L的KH2PO4研磨提取液冰浴研磨至匀浆，倒入离心管中，用0.04 mol/L的KH2PO4研磨提取液多次冲洗研钵，超声20 min 后转至4 ℃15 000 r/min离心20 min，取上清液，残渣重复提取，最后定容至10 mL容量瓶中，过0.22 μm微孔滤膜待测。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

根据1.3.3节方法配制不同质量浓度有机酸混合对照品溶液在相同条件下，连续进样5 次平行测定。以质量浓度（X）对峰面积（Y）进行线性回归分析，得到标准曲线，按照信噪比3∶1确定检出限，结果见表1。

表1 7 种有机酸和VC测定的线性相关性Table 1 L in ear equati on s for determ in ati on of sevenorganicacids and vitam in C

2.2 色谱条件的优化

本实验选择KH2PO4作为流动相，在对色谱条件的筛选过程中，发现随着流动相浓度和流速的升高，保留时间均有不同程度的延长，且分离度也越大；但流动相浓度大、流速快时，磷酸盐对泵和C18柱的损伤程度会增大，且流速越高，系统压力也越大。当柱温升高时，保留时间提前，且分离度也越大，但鉴于温度过高对有机酸挥发产生影响，因此综合考虑，最终选择KH2PO4的浓度为0.04 mol/L、流速为0.5 mL/min、柱温为30 ℃。在此条件下，7 种有机酸和VC可实现基线分离，且分离度较高，结果见色谱图1、2所示。

图1 有机酸和VC的混合对照品HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standards of organic acids and vitamin C

图2 骏枣果实样品（A）、0604酸枣果实样品（B）HPLC图Fig.2 HPLC chromatogram of Junzao jujube （A） and sour jujube （B）

表2 骏枣 果实 色谱 分析 数据Table 2 Analytical data of o rganica cids and vitam in Ci n Ju nzao jujub e by HP LC

表3 06 04酸 枣果 实中 有机 酸及 VC 含量 色谱 分析 数据Table 3 Analytical data of o rganica cids and vitam in Ci nsour jujube fruits by HP LC

由表2、3可知，6 种有机酸和VC的分离度较好，在此条件下，骏枣和0604酸枣果实样品中6种有机酸和VC可实现有效分离，琥珀酸未检测出。

2.3 精密度检测结果

将1.3.2节方法配制的有机酸混合对照品溶液在相同条件下，连续进行5 次平行测定，考察方法的精密度，根据其峰面积分别计算精密度，草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸和VC的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）范围在0.98%～4.77%之间，表明该方法的精密度良好。结果见表4。

表4 精密度实验（n=5）Table4 Results of p recisi on experiments （n= 5）

2.4 重复性检测结果

按照1.3.3节方法制备同一份枣果实样品5 份，按照1.3.1节色谱条件进样，根据其测得峰面积计算重复性（表5），在完熟期枣果实中未检测出琥珀酸含量，得出草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、VC 的RSD范围在0.88%～2.19%之间，表明该方法的重复性均达到分析的要求。

表5 重复性实验（n=5）Table5 Results of repeatability experiments（n= 5）

2.5 回收率测定结果

采用加标回收法。按照1.3.3节方法分别制备5 份相同质量且已知各组分含量的骏枣果实样品，分别加入相同体积不同质量浓度的有机酸对照品溶液，完全溶解后过0.22 μm微孔滤膜待测，按照1.3.1节色谱条件进样。各有机酸的平均回收率在91.35%～105.74%之间，表明该方法准确率较高，结果见表6。

表6 有机酸和VC加标回收实验结果（n=5）Table 6 Recovery rates of seven organic acids and vitam in C spiked in samples （n= 5）

2.6 枣果实样品有机酸和VC含量的测定

按照1.3.3节方法制备枣果实样品溶液，设3 次重复，按照1.3.1节色谱条件进样，测定骏枣、0604酸枣果实中有机酸和VC的组分和含量，见表7。

表7 枣果实中有机酸和VC的含量Table 7 C on tents o for ganicacids and vitam in C in jujubefruits

由表7可知，骏枣果实中有机酸以苹果酸、柠檬酸和酒石酸为主，占总酸含量的85.46%，含量分别为9.58、2.71、2.34 mg/g，其次依次为奎宁酸2.28 mg/g、草酸0.19 mg/g、富马酸0.01 mg/g，琥珀酸未检测到，其中，VC含量为2.17 mg/g。0604酸枣果实中有机酸以苹果酸、柠檬酸、酒石酸为主，占总酸含量的92.42%，分别为9.74、3.39、2.72 mg/g，其次是奎宁酸和草酸，分别为0.93 mg/g和0.37 mg/g，富马酸含量较少为0.05 mg/g，未检测到琥珀酸，VC含量为0.50 mg/g。在完熟期枣果实中除奎宁酸外酸枣中各有机酸含量均高于骏枣，而骏枣果实中VC含量高于0604酸枣。枣果实中6 种有机酸含量由高到低依次为：苹果酸＞柠檬酸＞酒石酸＞奎宁酸＞草酸＞富马酸。

3 讨论与结论

综上所述，枣果实中有机酸以苹果酸为主，因此可将其归为苹果酸型果实，这与李红卫等［21］的研究结果一致。孙延芳等［20］利用HPLC法检测得陕北地区酸枣鲜果中苹果酸、酒石酸的含量分别为6.77、1.83 mg/g，本实验对0604酸枣的检测与其研究结果相比，测得的含量相对较高，同时增加了对奎宁酸和富马酸的定量分析且分离效果较好（图1）。刘晓庚等［25］利用甲醇提取有机酸进行色谱分析，测得南酸枣中有机酸21 种，鉴定出19 种，其中苹果酸、柠檬酸、酒石酸的含量分别为1.95、2.30、1.40 mg/g，本研究与以上研究结果的差异可能与有机酸的提取方法、检测方法和酸枣品种的种源地不同有关。本实验采用二极管阵列检测器，Inertsil ODS-3色谱柱，以0.04 mol/L KH2PO4溶液为流动相，流速为0.5 mL/min，柱温30 ℃，检测波长为210 nm，有机酸和VC在30 min内得到有效分离和定量，从而建立了一种快捷、高效测定枣果实中有机酸和VC的方法。本方法较传统的有机酸测定方法灵敏度高，较气相色谱-质谱联用法［6］方便快捷。同时，本实验对南疆枣果实中的主要有机酸和VC进行了快速定量分析，这对南疆枣产品的研发具有实用价值，为枣果实中有效成分的质量评价提供科学依据。

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Simultaneous Determination of Organic Acids and Vitamin C in Jujube Fruits by HPLC

MA Qianqian1， WU Cuiyun1，2，*， PU Xiaoqiu1，WANG De1， SUN Yaqiang1
（1.Engineering Laboratory of Characteristic Fruit Tree Production in Southern Xinjiang， Xinjiang Production and Construction Corps，College of Plant Science， Tarim University， Alar 843300， China； 2.Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin， Tarim University， Alar 843300， China）

Objective: This study aimed to establish and validate a high performance liquid chromatographic （HPLC） method for the fast simultaneous determination of organic acids and vitamin C （VC） in jujube fruits.Methods: The analytes in samples were extracted ultrasonically in a water bath， centrifugated and purified by membrane filtration for analysis by HPLC with diode-array detection （DAD）.The chromatographic column used was Inertsil ODS-3 （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）.The separation was performed using 0.04 mol/L KH2PO4（pH 2.40） as mobile phase at 0.5 mL/min flow rate by isocratic elution.The column temperature and detection wavelength were set as 30 ℃ and 210 nm， respectively.Results: Under these chromatographic conditions， 7 organic acids and VC could be successfully separated in 30 minutes.The coefficients of determination （R2） of the standard calibration curves of the analyzed compounds were all above 0.998 9 and the precision expressed as relative standard deviations were between 0.98% and 4.77% （n = 5） and the repeatability RSDs were in the range of 0.88% to 2.19% （n = 5）.The mean recovery rates of seven organic acids and vitamin C were in the range of 91.35% to 105.74%.Conclusion: This method is an accurate， rapid， and applicable method to determine organic acids and vitamin C in jujube fruits.

high performance liquid chromatography （HPLC）； jujube； organic acid； vitamin C

10.7506/spkx1002-6630-201614026

S665.1

A

1002-6630（2016）14-0149-05

马倩倩， 吴翠云， 蒲小秋， 等.高效液相色谱法同时测定枣果实中的有机酸和VC含量［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 149-153.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614026. http://www.spkx.net.cn

MA Qianqian， WU Cuiyun， PU Xiaoqiu， et al.Simultaneous determination of organic acids and vitamin C in jujube fruits by HPLC［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 149-153.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614026. http://www.spkx.net.cn

2015-12-11

兵团科技创新团队建设项目（2014CC006）；兵团产学研重大专项（2013AA001-1）；

塔里木大学校长基金育种专项（TDYZZX201401）

马倩倩（1989—），女，硕士研究生，研究方向为果树遗传育种。E-mail：maqianqianqc@sina.com

*通信作者：吴翠云（1968—），女，教授，研究方向为果树种质资源与品种选育。E-mail：wcyby@163.com