黄妮雯， 宋盛仁， 杜　娟

(贵州医科大学附院 呼吸内科, 贵州 贵阳　550004)



卷柏总黄酮对支气管哮喘大鼠气道的影响*

黄妮雯， 宋盛仁， 杜娟*

(贵州医科大学附院 呼吸内科, 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 观察卷柏总黄酮(TFST)对哮喘大鼠气道炎症的影响，并探讨其可能机制。 方法： 将48只雄性SD大鼠随机分为对照组、哮喘模型组、TFST组，哮喘组与TFST组腹腔注射及雾化吸入卵蛋白诱导大鼠哮喘发作，TFST组预先给予TFST干预，对照组给予生理盐水；酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素-5(IL-5)水平，并进行炎性细胞计数，SABC免疫组织化学法检测气道上皮细胞信号转录因子与转录活化因子1(STAT1)的表达，并对各指标的关系进行相关性分析。结果： TFST组大鼠气道炎症病理改变较哮喘组减轻，BALF中IL-5水平、白细胞总数(WBC)、嗜酸性粒细胞数(EOS)及支气管上皮细胞STAT1表达水平低于哮喘组(P<0.01)； BALF中IL-5水平与气管上皮细胞STAT1水平呈正相关(r=0.56，P<0.05)。结论： TFST可降低哮喘大鼠IL-5的表达和炎性细胞聚积，与抑制STAT1的表达有关。

[关键词]卷柏总黄酮； 哮喘； 炎症； 信号转录因子与转录活化因子1； 白细胞介素-5

气道慢性炎症是哮喘基本的病理生理学特征之一[1]，而白细胞介素-5(IL-5)的过度表达和持续作用可导致气道的慢性炎症[2]。信号转导子和转录激活子(signal transducer and activator of transcription ，STAT)家族可在多种类型的组织及细胞中表达[3]，且具有众多生物学功能，哮喘时STAT表达水平或功能可能异常[4]。STAT成员之一STAT1在哮喘的发生发展中起着重要的作用，哮喘支气管上皮细胞STAT1上调，并可诱导产生多种细胞因子如IL-5、白细胞介素-6、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等，进一步使气道炎症细胞聚集[5]。卷柏为蕨类卷柏科卷柏属植物，卷柏总黄酮(total flavonoids ofSelaginellatamariscina, TFST)为其主要活性成分[6]，具有抗炎抗肿瘤、抑菌抗病毒等多种作用，并可用于哮喘的治疗[7]，但其作用机制尚不清楚。本研究探讨TFST在调控哮喘气道炎症中的作用及可能机制。

1材料与方法

1.1材料

卷柏总黄酮购于吉林天药药物研发有限公司植物化学研究室，卵蛋白购于美国 sigma公司，白介素5(IL-5)ELISA试剂盒、SABC免疫组化染色试剂盒购于碧云天生物技术研究所。

1.2方法

1.2.1分组及造模健康雄性SD大鼠 48 只(贵州医科大学实验动物中心)，随机均分为正常对照组、哮喘组及TFST组(每组16只)。哮喘组及TFST组大鼠腹腔注射含氢氧化铝200 mg及卵蛋白100 mg的1 mL混合液致敏，之后两周给予卵蛋白超声雾化激发，每天1次；TFST组大鼠在每次激发前30 min，给予卷柏总黄酮混悬液800 mg/kg灌胃，连续2周；对照组大鼠腹腔注射及雾化吸入生理盐水。于给药后第14天处死各组大鼠，并检测相应指标。

1.2.2获取大鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalve-olar lavage fluid,BALF)用1%戊巴比妥钠以33 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，打开胸腔后首先结扎右主支气管并于大鼠气管下部做横切口,经切口注入4 mL灭菌生理盐水灌洗左肺15 s后回吸得到BALF。将获取的BALF离心，用生理盐水重悬加入血细胞计数器，在显微镜下计数WBC，按照各类细胞百分比计算嗜酸性粒细胞数(EOS)。

1.2.3气管壁及壁旁肺组织EOS浸润密度取各组大鼠右肺中叶组织于多聚甲醛中固定后脱水、包埋、切片，行HE染色，400倍光镜下观察支气管壁及其壁旁肺组织EOS的浸润情况；随机选取10个视野计数EOS，取各视野的平均值作为代表值。

1.2.4IL-5测定BALF离心后取其上清液,用ELISA测定IL-5水平，严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.5STAT1表达采用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法对气道上皮细胞进行STAT1免疫组织化学染色，按试剂盒说明书测定STAT1表达。细胞内出现明显的黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数<10%为(-)，10%～<25%为(+)，25%～50%为(++)，>50%为(+++)。

1.3统计学方法

2结果

2.1一般情况

造模后，哮喘组大鼠均出现明显烦躁、呼吸短促、腹肌快速抽搐、咳嗽等哮喘发作症状；TFST组大鼠发作程度明显较哮喘组减轻，对照组大鼠无明显哮喘发作症状。

2.2BALF中WBC及EOS数量、IL-5水平

TFST组BALF中IL-5水平及WBC及EOS数量低于哮喘组，而高于正常对照组。见表1。

表1　3组大鼠BALF中IL-5水平、炎性细胞水平

(1)与对照组比较，P<0.01；(2)与哮喘组比较，P<0.01

2.3气管壁及壁旁肺组织EOS浸润度

对照组、哮喘组及TFST组大鼠气管壁及壁旁肺组织EOS的浸润度分别为400倍光镜下每个视野(7±2)、(29±6)、(18±2)个细胞，3组比较差异有统计学意义(P<0.05)，TFST组低于哮喘组。

2.4支气管上皮细胞STAT1表达

TFST组较哮喘组STAT1的表达减少。见表2、图1。

2.5各指标间的相关性分析

大鼠气管壁及壁旁肺组织中EOS计数与BALF中EOS计数呈正相关，在TFST组中r=0.87，P<0.01；在哮喘组r=0.80，P<0.01。BALF中IL-5水平与EOS计数呈正相关，在哮喘组中r=0.83，P<0.01；TFST组r=0.79，P<0.01。大鼠支气管上皮细胞STATl表达与BALF中IL-5水平呈正相关， 哮喘组r= 0.79，P<0.01；TFST组r=0.56，P<0.05。

表2　3组大鼠支气管上皮细胞STAT1表达阳性率

(1)为与对照组比较，P<0.01；(2)为与哮喘组比较，P<0.01

注：A为对照组大鼠，支气管上皮完整，无明显STAT1表达；B为哮喘组大鼠，支气管上皮细胞受损，可见明显STAT1表达；C 为TFST组大鼠，支气管上皮细胞受损及STAT1表达较哮喘组减少图1　三组大鼠支气管上皮细胞STAT1表达(SABC，×200)Fig.1　STAT1 protein expression of bronchial epithelial cells in each group

3讨论

气道慢性炎症在哮喘发生发展中起至关重要的作用,所以抑制气道炎症历来为控制哮喘的关键。卷柏属植物在中国资源丰富并且分布广泛,其主要活性成分为TFST[8-9]。民间用其治疗慢性支气管炎及哮喘等气道慢性炎症，但对于其作用机制缺乏相应的科学研究。本研究旨在探讨TFST对于哮喘大鼠气道炎症的影响及可能的机制。

研究表明，IL-5的过度表达可持续活化骨髓嗜酸性祖细胞，使EOS产生增多,而EOS在气道蓄积可导致慢性气道炎症[10]。STAT蛋白家族对信号转导的影响主要通过细胞因子介导， 细胞因子可通过 JAK/STAT途径激活 STAT的表达而诱发炎症疾病的发生[11]。与哮喘关系最紧密的STAT家族成员为STAT1，其在哮喘气道慢性非特异性炎症的发生中起重要作用[12]。存在慢性气道炎症时, 支气管上皮细胞STAT1的选择性活化及过度表达，进一步使其合成及分泌多种细胞因子，这些细胞因子又反过来诱发炎症细胞活化，使其释放炎症介质并促进炎症细胞的趋化[13]。为探讨TFST对哮喘气道炎症的影响，以及气道上皮细胞STAT1的表达及与IL-5的相关性，本研究建立了标准的大鼠哮喘模型，用TFST灌胃干预，结果表明予TFST干预后大鼠BALF中EOS及炎性细胞总数较哮喘模型大鼠明显减少；BALF中IL-5水平也明显降低，EOS和IL-5呈正相关，说明TFST具有调控哮喘大鼠气道炎症的作用，且能降低大鼠气道上皮细胞 STAT1的表达，提示TFST有可能是通过抑制 STAT1的表达来抑制哮喘时细胞因子介导的信号转导过程，从而控制哮喘的病理变化。

TFST对哮喘大鼠气道炎症有明显的抑制作用，可以减少IL-5的表达和炎性细胞聚积，与降低 STAT1的表达有关。

4参考文献

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(2016-04-12收稿，2016-06-04修回)

中文编辑： 周凌； 英文编辑： 赵毅

*通信作者E-mail:dujuan0888@tom.com

[中图分类号]R562.25

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)07-0797-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.013

Effect of Total Flavonoids ofSelaginellatamariscinaon Airway of Asthmatic Rats

HUANG Niwen, SONG Shengren, DU Juan

(DepartmentofInternalMedicine,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004，Guizhou，China)

[Abstract]Objective: To investigate the total flavonoids of Selaginella tamariscinaon (TFST) on airway inflammation and the expression of STAT1 protein in bronchial epithelium of asthma rats. Methods： 48 male rats were randomly divided into control group, bronchial asthma model group and TFST group. The asthma model of rats was set up with nebulization aspiration and intraperitoneal injection of ovalbumin (OVA).The TFST group was given TFST protection interventions in advance. Using ELISA for each group of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of interleukin-5 (IL-5) concentrations were measured and to detect the number of inflammatory cells in BALF. STAT1 protein expression in airway epithelial cells was determined by SABC immunohistochemistry method. Results： The pathological changes of airway inflammation in TFST group were significantly reduced, of which level of IL-5, WBC counts and EOS counts in BALF were significantly decreased compared with that in the asthma model group (P<0.01).The STAT1 protein expression in bronchial epithelium and the concentration of IL-5 in BALF were obviously increased in bronchial asthma model group，and positively related. The expression of STAT1 in TFST group was significantly lower than those in asthma model group. Conclusion: TFST can inhibit the IL-5 of asthmatic rats and accumulation of inflammatory cells, the mechanism may involve in inhibiting the expression of STAT1.

[Key words]total flavonoids of Selaginella tamariscinaon； asthma； inflammation；signal transducer and activator of transcription; interluekin-5

网络出版时间：2016-07-17网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.040.html