徐　多,何莲芝

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院　妇产科，安徽　芜湖　241001)



·临床医学·

人乳头瘤病毒HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈病变诊断中的价值

徐多,何莲芝

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院妇产科，安徽芜湖241001)

【摘要】目的：评估HPV E6/E7 mRNA在宫颈病变诊断中的价值。方法：选取弋矶山医院2014年9月～2015年9月HPV DNA阳性且TCT检测为慢性宫颈炎患者197例，行HPV E6/E7 mRNA及阴道镜下宫颈组织病理学检测。结果：197例HPV阳性患者中，HPV E6/E7 mRNA的阳性率为62.44%，敏感度为91.18%，特异度为52.17%，阳性预测值为50.14%，阴性预测值为91.89%。不同组织学分级中，HPV E6/E7 mRNA的阳性表达率在宫颈炎组与CINⅠ组、宫颈炎组与Ⅱ组、宫颈炎组与Ⅲ组均具有统计学差异(P<0.01)。HPV E6/E7 mRNA检测与病理学诊断符合率为90%。结论：HPV E6/E7mRNA的表达与宫颈病变密切相关，可用于评估宫颈癌的发病风险。在早期或低级别病变中，HPV E6/E7 mRNA检测对预测高级别宫颈上皮内瘤变的发生有着重要作用。

【关键词】人乳头瘤病毒；HPV E6/E7 mRNA；子宫颈上皮内瘤样病变

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.03.007

宫颈癌是目前女性最常见的恶性肿瘤之一，且是目前所有癌症中唯一病因明确、可以早期预防和治疗、并能根除的癌症[1]。研究表明，高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持续感染是导致宫颈癌发生的必要因素[2]。HPV是一组双链DNA病毒，其基因组可分为早期转录区(E区)、晚期转录区及上游调节区，其中早期转录区的E6和E7为病毒的癌基因，可干扰细胞周期，抑制细胞凋亡，与肿瘤的发生与发展密切相关。E6 蛋白通过招募E6AP 泛素酶[4]，与E6 相关蛋白(E6 associated protein，E6-AP) 结合到 p53 ，使p53失活，E7蛋白通过与视网膜母细胞瘤蛋白pRb结合，使停止分裂的细胞重新进入S期，从而促进细胞增殖[5]。目前临床上较多采用HPV DNA 联合细胞学检测筛查宫颈癌，然而此类方法均以病毒DNA为检测目标，以此判定病毒类型及负荷量。实际上宫颈细胞病变并不仅与病毒类型及负荷量有关，更与致癌基因的活动程度关系密切。HPV E6/E7蛋白作为病毒活动指标，对HPV的致癌活动程度具有非常重要的临床辅助诊断价值[6]。本文采用支链DNA(b-DNA)技术检测HPV E6/E7 mRNA,对实验结果进行分析，探讨HPV E6/E7 mRNA在宫颈病变诊断中的价值。

1资料与方法

1.1一般资料选取弋矶山医院2014年9月～2015年9月HPV DNA阳性且TCT检测为慢性宫颈炎患者197例，排除有免疫抑制、慢性疾病、宫颈上皮内瘤变(CIN)治疗史者。所有患者同时行HPV E6/E7 mRNA及阴道镜下宫颈组织活检，以组织学结果为金标准进行比较分析。根据宫颈组织病理学结果分为CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组。

1.2方法

1.2.1样本采集患者检查前3 d不使用阴道内药物，不做阴道冲洗，24 h内禁止性生活，并在非经期检查。窥阴器暴露宫颈后，使用宫颈细胞专用采样刷插入宫颈口旋转3～5周，停留10 s,将刷头放入装有专用保存液的瓶内并编号。

1.2.2HPV E6/E7 mRNA检测将采集样本倒入15 mL离心管，3000 r/min离心5 min后倒掉上清液，用2 mL蒸馏水清洗后再次离心，去上清液，加入300 μL裂解剂和3 μL蛋白酶K，放入65℃恒温箱30 min,取出后收集上清液，采用高危HPV E6/E7 mRNA检测试剂盒进行检测，操作步骤严格按照说明书进行，经计算机软件自动读取HPV E6/E7 mRNA拷贝数值。

1.2.3病理组织学检查所有197例患者均行阴道镜检查，先用低倍镜观察宫颈外观、颜色、血管及有无白斑。3%醋酸棉球浸湿宫颈表面，3 min后观察上皮血管，再用复方碘溶液棉球浸湿宫颈。在阴道镜图像异常区或碘实验阴性区取多点活检，若镜下为正常转化区，则分别在3、6、9、12点处取活检。

1.3诊断标准

1.3.1组织学诊断按照世界卫生组织2004年病理组织学分类标准，根据细胞异型性程度和范围的不同，依次诊断为：慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅰ级(CINⅠ)、宫颈上皮内瘤样病变Ⅱ级(CIN Ⅱ)、宫颈上皮内瘤样病变Ⅲ 级(CIN Ⅲ)及鳞癌(SCC)。

1.3.2HPV E6/E7 mRNA的检测结果由计算机软件自动读取，将拷贝值≥1为阳性判断标准。低危风险(1～4000拷贝)；中危风险(4000～10 000拷贝)；高危风险(﹥10 000拷贝)。

1.4统计学方法采用SPSS 18.0统计软件对所有数据进行运算，不同病理级别E6/E7 mRNA检出率差别采用配对χ2检验，检验标准α=0.05。

2结果

2.1HPV E6/E7 mRNA检测对宫颈病变的诊断价值197例HPV DNA阳性患者中，HPV E6/E7 mRNA阳性共123例，阴性74例；组织病理结果为慢性宫颈炎129例，CIN 68例，其中HPV E6/E7 mRNA阴性，组织病理结果为CIN 6例。HPV E6/E7 mRNA的敏感度为91.18%(62/68)，特异度为52.17%(68/129)，阳性预测值为50.14%(62/123)，阴性预测值为91.89%(68/74)，相较于HPV DNA34.51%(68/197)的阳性预测值，HPV E6/E7 mRNA的阳性预测值高于HPV DNA，且有较高的敏感度及阴性预测值。

图1HPV E6/E7 mRNA在正常宫颈组织中的阴性表达(Elivision染色)

图2HPV E6/E7 mRNA在CIN组织中的阳性表达(Elivision染色)

2.2HPV E6/E7 mRNA检测与宫颈上皮内瘤变之间的关系197例宫颈组织标本中，检测出 HPV E6 /E7 mRNA阳性标本123例，阳性率62． 44%，其中宫颈炎组61例(47.29%)，CINⅠ组21例(87.50%)，CINⅡ组18例(94．74%)，CINⅢ组23例(92．00%)。见表1。

表1各组宫颈病变中HPV E6/E7 mRNA的表达率

病理分型例数阳性数阳性率/%炎症组1296147.29CINⅠ组242187.50CINⅡ组191894.74CINⅢ组252392.00

由表1可知，炎症组分别与CIN各组阳性率差异具有统计学意义(χ2值依次为11.59、13.14、15.11,P均<0． 01)；而CIN各组两两之间阳性率差异无明显统计学意义(P>0．05)。

2.3HPV E6/E7 mRNA风险程度与宫颈病变之间的关系197例HPV DNA阳性患者中，根据组织病理结果，上皮内瘤样病变Ⅰ级(CIN Ⅰ)为低级别病变，上皮内瘤样病变Ⅱ级(CIN Ⅱ)及以上为高级别病变。根据HPV E6/E7 mRNA检测拷贝值 ，低危风险103例(其中病理组织学正常60例，低级别病变 20例，高级别病变23例)，中危风险组 13例(病理组织学结果低级别病变1例，高级别病变12例)，高危风险组7 例(病理组织学结果正常1例，高级别病变6例)阳性率85.71%。其中病理诊断为高级别病变20例，HPV E6/E7 mRNA检测为中危组以上为18例，HPV E6/E7 mRNA检测与病理学诊断符合率为90%。

3讨论

宫颈病变的主要原因是HPV感染，研究发现，99.7%的宫颈癌患者均具有HPV的感染[6]。然而从HPV感染进展到宫颈癌需经过很长一段时间。HPV感染后可在体内长期处于潜伏状态，90%的 HPV感染者可通过自身免疫功能进行清除，只有5%～10%的高危持续感染者进展为宫颈癌[7]。宫颈上皮内瘤变反映了宫颈癌发生发展的连续过程，HPV 感染也是 CIN 进展为宫颈癌的重要诱因[8]。高危型HPV可产生E6和E7两种癌蛋白，E6蛋白使p53失活，从而使细胞转向恶性增殖。同时E6 蛋白与PDZ 蛋白结合,介导PDZ 蛋白的降解，PDZ蛋白功能与细胞信号转导、细胞黏附等相关。PDZ蛋白水平的降低被认为在宫颈癌的发展过程中起了重要作用。E6蛋白也可以直接激活端粒酶，导致细胞永生化，从而导致宫颈癌的发生。E7蛋白可与pRb结合，降低抑癌基因的活性，使pRb/E2F 复合物分解，释放E2F1，促进细胞增殖[9]。

本研究采用b-DNA 技术检测了HPV阳性患者中HPV E6/E7 mRNA的表达。结果表明，宫颈炎症组的HPV E6/E7 mRNA 阳性表达率显著低于宫颈病变组，在高级别病变中(CINⅡ及以上)的表达率也明显高于低级别病变(CIN Ⅰ)。宫颈组织标本病理分级与 HPV E6/E7 mRNA 表达量成正相关。由此可见，HPV E6/E7 mRNA能够更好评估宫颈癌发病风险。Ratnam等[10]研究发现HPV E6/E7 mRNA阳性率随着宫颈病变的加重而增加，本研究中HPV E6/E7 mRNA在炎症组、CINⅠ～ Ⅲ 组中的阳性率分别为47.29%、87.50%%、94.74%、92.00%，炎症组和CINⅠ组、CIN Ⅱ组、CIN Ⅲ组之间阳性率差异具有统计学意义；且在阳性预测值上，HPV E6/E7 mRNA优于HPV DNA检测，本文结论与相关文献报道相符[11]。HPV感染人群中，有80%的感染者两年内会自行消退，从HPV感染到宫颈病变的发生，需历经数年。HPV E6/E7 mRNA是病毒癌基因转录产物，表现癌基因活性，故相对于HPV DNA检测，有更精准更直接的意义。有研究表明，在鉴别短暂的宫颈异常与可能进一步发展的宫颈病变中，HPV E6/E7 mRNA检测相比HPV DNA检测有着更高的特异度，可以降低HPV DNA检测阳性给患者所带来的心理负担[12]。可以预见，经过大规模样本累计后，对于存在HPV感染的患者，而细胞学检测正常时，HPV E6/E7 mRNA 表达量的高低对是否经行阴道镜检查甚至宫颈组织活检具有重要临床应用价值，可以达到分流门诊HPV感染及早期或低级别宫颈病变患者的目的。因此， HPV E6/E7 mRNA 表达量的定量检测，对于早期及时发现、预防、治疗宫颈癌、协助临床诊断、评估宫颈癌发病风险及预后有着重要的意义。

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Value of human papillomavirus E6/E7 mRNA detection in diagnosis of cervical lesions

XU Duo,HE Lianzhi

Department of Gynecology & Obstetrics,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

【Abstract】Objective：To assess the value of human papilloma virus(HPV) E6/E7 mRNA detection in the diagnosis of cervical lesions.Methods:A total of 197 HPV positive cases confirmed as chronic cervicitis by Thin-prep liquid-based Cytology Test(TCT) were included from Yijishan Hospital of Wannan Medical College between September of 2014 and 2015,and all patients were given further detection of HPV E6/E7 mRNA as well as colposcopy and cervical biopsy.Results:In the 197 cases,positive HPV E6/E7 mRNA was 62.44%,and mRNA sensitivity was 91.18%; specificity,52.17%; positive predictive value,50.14%; negative predictive value,91.89%.By histological grading,the difference was significant regarding the positive rate of HPV E6/E7 mRNA between inflammatory group and cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅰ,CIN Ⅱor CIN Ⅲ(P<0.01).The result of HPV E6/E7 mRNA expression was consistent with that of pathological findings in 90% of the cases.Conclusion:HPV E6/E7 mRNA expression is closely correlated with cervical lesions,and can be a useful tool to assess the risks of malignancy.Particularly,HPV E6/E7 mRNA detection can competently predict high grade CIN from early or low grade cervical lesions.

【Key words】human papillomavirus; HPV E6/E7 mRNA; cervical intraepithelial neoplasia

文章编号：1002-0217(2016)03-0230-04

收稿日期：2015-12-06

作者简介：徐多(1989-)，女，2013级硕士研究生，(电话)13866372153，(电子信箱)xdwnyxy@163.com;

【文献标识码】【中图号】R 737.33A

何莲芝，女，主任医师，(电子信箱)429094335@qq.com，通讯作者.