薛　冰，梁琳琅，宋　威，孙连庆



人参皂苷Rb1抑制间歇性高糖诱导的雪旺细胞凋亡

薛冰1，梁琳琅1，宋威1，孙连庆2*

1.沈阳军区总医院内分泌科，沈阳 110016；2.西安交通大学第一附属医院中医科，西安 710061

[摘要]目的探讨人参皂苷Rb1对间歇性高糖培养条件下雪旺细胞凋亡的影响。方法无菌剥取新生Sprague-Dawley乳鼠坐骨神经，体外制备雪旺细胞，分为对照组(培养液葡萄糖浓度为5.6 mmol/L，Con组)、间歇性高糖组(培养液葡萄糖浓度为5.6 mmol/L和50 mmol/L,每8小时交替，IHG组)、干预组(在间歇性高糖基础上加入100 μmol/L人参皂苷Rb1，IHG+Rb1组)分别培养48 h。采用AnnexinV/PI双染色、流式细胞仪检测细胞凋亡，ELISA法检测8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)水平，实时荧光定量PCR法检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax的mRNA表达，蛋白印迹法检测Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果与对照组相比，间歇性高糖促进了雪旺细胞凋亡(P<0.05)，增加了8-OHdG的生成(P<0.01)，IHG组细胞凋亡率和8-OHdG水平分别是Con组的7.69倍、3.24倍；间歇性高糖上调了Bax的mRNA和蛋白表达，下调了Bcl-2的mRNA和蛋白表达。与IHG组相比，人参皂苷Rb1抑制了IHG导致的雪旺细胞凋亡和8-OHdG生成，IHG+Rb1组细胞凋亡率和8-OHdG水平较IHG组分别下降了54.1%和32.7%(P<0.05)；同时下调了Bax的mRNA和蛋白表达，上调了Bcl-2的mRNA和蛋白表达(P<0.05)。结论间歇性高糖可促进雪旺细胞凋亡，人参皂苷Rb1能够减轻间歇性高糖造成的凋亡，具有一定的神经保护作用。

[关键词]人参皂苷Rb1;雪旺细胞;凋亡

0引言

糖尿病周围神经病变(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病患者最常见的慢性并发症，严重影响患者的生活质量和寿命[1]。DPN的发病机制十分复杂，其主要病理基础是高血糖，但连接这一代谢紊乱和各种病理生理改变的确切机制尚不完全清楚。已有研究显示，高糖状态，尤其是间歇性高糖(Intermittent high glucose，IHG)，通过诱发线粒体产生过度氧化应激、促发神经元及神经胶质细胞凋亡，造成神经损伤[2]。雪旺细胞是周围神经系统特有的功能细胞，但是目前关于雪旺细胞在间歇性高糖条件下的功能变化及机制研究并不多见。本研究通过体外培养雪旺细胞，观察间歇性高糖条件下以及给予人参皂苷Rb1干预后凋亡相关指标的变化，探讨人参皂苷Rb1改善神经细胞损伤的可能机制。

1材料

1.1实验动物出生3 d的Sprague-Dawley乳鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，合格证号[SCXK(京)2007-0001]。

1.2主要仪器与试剂HERAcell细胞培养箱(德国Heraeus公司)，DU640型分光光度计(美国Backman公司)，FACSAsia流式细胞仪(美国BD公司)，垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)，SLAN荧光定量PCR检测系统(上海宏石医疗科技公司)。胎牛血清及胰蛋白酶(美国Hyclone公司)，葡萄糖、G-418、DMEM培养基(美国Gibco公司)，人参皂苷Rb1(上海欣博盛生物科技公司)，兔抗鼠S-100多克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒和HRP标记的二抗(北京中杉金桥公司)，DNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，细胞凋亡检测试剂盒(北京嘉美生物公司)，大鼠8-OHdG ELISA检测试剂盒(加拿大StressMarq生物科学公司)，cDNA合成试剂盒和SYBR预混试剂盒(美国Invitrogen公司)，兔抗鼠Bcl-2、Bax、β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)。

2方法

2.1雪旺细胞的培养、纯化和鉴定脱颈处死Sprague-Dawley乳鼠，无菌分离并切取双侧坐骨神经，仔细剥离神经外膜，尽量去除束膜，用D-Hank′s液漂洗后，将神经组织剪碎至0.5～1 mm2，均匀接种于T25培养瓶内，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，采用差速贴壁法、低浓度胰酶消化(0.05%胰蛋白酶及0.02%EDTA)加100 μg/mL G418纯化并传代培养。选取第3代生长良好的细胞，消化制成单细胞悬液，按1×105/孔的密度接种到预置有盖玻片的6孔板内继续培养，待细胞生长成单层时，取出盖玻片，进行S-100蛋白免疫组化鉴定。

2.2实验分组结合本课题组的前期工作基础，分别以5.6 mmol/L、50 mmol/L为正常葡萄糖、高葡萄糖浓度，以100 μmol/L人参皂苷Rb1进行药物干预。将生长良好的雪旺细胞按照1×106/mL密度接种于培养瓶中，待细胞均匀铺满瓶底后，按以下条件分组继续培养48 h。实验分组如下：①对照组(Con组)：DMEM培养基+20%大鼠血清+5.6 mmol/L葡萄糖；②间歇性高糖组(IHG组)：DMEM培养基+20%大鼠血清+5.6 mmol/L或50 mmol/L葡萄糖，每8小时交替换液1次；③干预组(IHG+Rb1组)：在IHG培养基础上加入终浓度100 μmol/L人参皂苷Rb1。

2.3雪旺细胞凋亡的检测分组收集细胞，PBS洗涤2次，加入400 μL结合缓冲液悬浮细胞。加入Annexin V/FITC和PI各5 μL后混匀，室温下避光反应10 min，采用流式细胞仪检测荧光强度，每组计数1×104个细胞，激发波长488 nm，发射波长530 nm。

2.4雪旺细胞8-OHdG水平的检测分别提取细胞总DNA，采用分光光度计检测定量，参照试剂盒操作说明检测DNA样本中8-OHdG水平。具体如下：用50 μL含有100 mmol/L乙酸钠和5 mmol/L氯化镁的反应混合液重悬200 μg DNA样本，加入1 μL DNase室温下消化10 min。取含有8-OHdG的微量滴定板,每孔加入50 μL的样本或对照品，随即每孔加入50 μL一抗，37 ℃孵育1 h。弃去孔中液体,振荡洗涤30 s×3次，每孔加入100 μL二抗，摇晃混匀，37 ℃孵育30 min。弃去孔中液体,振荡洗涤30 s×3次，每孔加入100 μL着色剂，混匀后避光、室温下放置15 min。最后加入100 μL终止液，室温放置2 min。应用酶标仪测定光密度值(波长450 nm)，绘制标准曲线，计算各样本中的8-OHdG含量。

2.5雪旺细胞Bax和Bcl-2 mRNA表达的检测采用Trizol法提取细胞总RNA，电泳鉴定并定量，按照cDNA合成试剂盒操作说明逆转录合成cDNA，根据目的基因及扩增条件进行扩增。Bax (209 bp)：上游引物5′-GGCGAATTGGAGATGAACTG-3′，下游引物5′-GATCAGCTCGGGCACTTTAG-3′；Bcl-2 (225 bp)：上游引物5′-GCGTCAACAGGGAGATGTCA-3′，下游引物5′-GGTATGCACCCAGAGTGATG-3′；GAPDH (256 bp)：上游引物5′-TGTCTCCTGCGACTTCAACAG- 3′，下游引物5′-GAGGCCATGTAGGCCATGAG-3′。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃25 s，共40个循环。实验重复3次，计算各组目的基因和GAPDH Ct值的差值(ΔCt)，以2-ΔΔCt表示目的基因与内参基因GAPDH的相对表达量。

2.6雪旺细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的检测提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法定量并调整蛋白浓度。每孔加入50 μg蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳后电转至PVDF膜上，0.5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入兔抗鼠Bax、Bcl-2、β-actin抗体(1∶200稀释)4 ℃过夜，TBST洗涤，加入HRP标记的二抗(1∶5 000稀释)室温孵育90 min，ECL显色，X线曝光显影。Image Tool软件测定光度值。

3结果

3.1雪旺细胞的形态及鉴定剪碎的神经组织贴壁后第2天即可观察到有细胞从组织块浮出。多数细胞呈梭形生长，细胞核为卵圆形，胞体较小且饱满，有细长突起，呈双极或多极，纯化培养后细胞生长良好，聚集成网格状或漩涡状。S-100抗体免疫组化染色后雪旺细胞纯度达95%以上。

3.2各组雪旺细胞凋亡率的比较与Con组相比，IHG组细胞凋亡率明显增加，是Con组的7.69倍(P<0.01)。人参皂苷Rb1减轻了间歇性高糖引起的雪旺细胞凋亡，与IHG组相比，IHG+Rb1组细胞凋亡率明显下降，较IHG组下降了54.1%(P<0.05)，结果见图1。

图1　各组雪旺细胞凋亡率的比较

3.3各组雪旺细胞8-OHdG水平的比较与Con组相比，IHG组雪旺细胞的8-OHdG水平明显增加，是Con组的3.24倍(P<0.01)。人参皂苷Rb1抑制了间歇性高糖引起的雪旺细胞8-OHdG增高，同IHG组相比，IHG+Rb1组雪旺细胞的8-OHdG水平明显减少，较IHG组减少了32.7%(P<0.05)，结果见图2。

3.4各组雪旺细胞Bax和Bcl-2 mRNA表达水平的比较与Con组相比，IHG组Bax mRNA表达水平明显增高，是Con组的2.42倍(P<0.05)；Bcl-2 mRNA表达水平明显降低，是Con组的46.2%(P<0.05)。人参皂苷干预拮抗了间歇性高糖对Bax和Bcl-2 mRNA表达水平的影响，同IHG组相比，IHG+Rb1组Bax mRNA表达水平下降为IHG组的73.2%(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表达水平升高为IHG组的1.78倍(P<0.05)，结果见图3。

图2　各组雪旺细胞8-OHdG水平的比较

图3　各组雪旺细胞Bax和Bcl-2 mRNA表达水平的比较

3.5各组雪旺细胞Bax 和Bcl-2蛋白表达水平的比较与Con组相比，IHG组Bax 蛋白表达水平明显增高，是Con组的2.81倍(P<0.05)；Bcl-2蛋白表达水平明显降低，是Con组的36.7%(P<0.05)。人参皂苷干预逆转了间歇性高糖对Bax和Bcl-2蛋白表达水平的影响，同IHG组相比，IHG+Rb1组Bax 蛋白表达水平下降为IHG组的49.1%(P<0.05)，Bcl-2 蛋白表达水平升高为IHG组的2.08倍(P<0.05)，结果见图4。

4讨论

糖尿病周围神经病变的发病机制十分复杂，可能与多种因素有关，包括：糖脂代谢紊乱、神经缺血缺氧、多元醇通路异常、蛋白激酶C激活、非酶糖基化终产物形成、神经营养因子缺乏、氧化应激、炎症、免疫机制异常等。其中，Brownlee[3]提出的糖尿病血管并发症统一机制——氧化应激学说近年来备受关注：高糖引起组织细胞的线粒体超氧化物产生过多、促发氧化应激，并激活炎症、凋亡等其他代谢途径，是糖尿病慢性并发症的共同发病机制。

图4　各组雪旺细胞Bax和Bcl-2 蛋白表达水平的比较

雪旺细胞是周围神经特有的髓鞘形成细胞，是DPN的主要靶细胞，在维持神经结构、功能以及修复神经损伤过程中起重要作用[4]。雪旺细胞内线粒体丰富，能量代谢旺盛，因而对高糖引起的氧化应激高度敏感。高糖可引起线粒体电子传递链超负荷、分裂形成片段，诱发ROS产生过量。基础和临床研究表明，血糖过度波动对糖尿病血管并发症的危害可能超过血糖绝对水平的作用，间歇性高糖比稳定性高糖更容易激活氧化应激反应，加剧包括DPN在内的糖尿病慢性血管并发症的发生发展[5-6]。

氧化应激反应可通过碱基修饰、直接断裂及改变核酸构象等方式造成DNA损伤，其中最主要的致突变性损伤反应是C-8上鸟嘌呤和胸腺嘧啶碱基的颠换突变，生成8-OHdG。8-OHdG是DNA氧化损伤主要的特异性的代谢终产物，只能通过DNA氧化损伤途径形成，且可以在体内稳定存在，因此被公认为内源性及外源性因素造成DNA氧化损伤的标志物[7]。本研究将雪旺细胞在间歇性高糖条件下体外培养48 h，发现间歇性高糖可以明显增加8-OHdG生成，促进了雪旺细胞内氧化应激。

氧化应激增加可以直接或间接损伤雪旺细胞线粒体膜的通透性，线粒体膜通透性转运孔开放，线粒体跨膜电位下降，线粒体膜通透性增加，细胞色素酶C、凋亡诱导因子等致凋亡物质从线粒体膜间腔释放，通过Caspase或非Caspase信号途径引起细胞凋亡。Bcl-2蛋白可以调节线粒体膜通透性、减少促凋亡物质释放，抑制凋亡发生。而在凋亡信号刺激下，胞浆中的Bax蛋白可以转移至线粒体膜并与膜上的Bcl-2形成异源二聚体，改变Bcl-2构象并抑制其表达，从而促进凋亡发生。本研究显示，间歇性高糖也影响了凋亡相关信号通路的调控，上调促凋亡因子Bax的mRNA和蛋白表达，下调凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA和蛋白表达，雪旺细胞凋亡率明显增加。

人参皂苷Rb1是传统中药人参的主要活性组分之一，具有抗氧化、抗凋亡、降糖、降脂等多种药理作用。Wu等[8]发现，人参皂苷Rb1可以减轻糖尿病大鼠的心肌缺血/再灌注损伤，其心血管保护效应至少部分与激活PI3K/Akt信号通路有关。Tsai等[9]发现，人参皂苷Rb1具有促进受损的周围神经再生修复的作用。Huang等[10]研究显示，人参皂苷Rb1可以减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤，抑制神经元凋亡。本研究在间歇性高糖条件下给予人参皂苷Rb1(根据前期实验结果选择100 μmol/L最佳浓度)进行干预，发现其可以抑制8-OHdG生成，降低雪旺细胞DNA氧化损伤，逆转间歇性高糖引起的Bax mRNA和蛋白表达上调、Bcl-2 mRNA和蛋白表达下调，雪旺细胞凋亡率明显减低。这说明人参皂苷Rb1对于间歇性高糖诱导的雪旺细胞损伤具有明显的保护效应。

综上所述，本研究初步显示，间歇性高糖可以诱发神经细胞的DNA氧化损伤，促进细胞凋亡，提示合理控制血糖、避免血糖过度波动在DPN治疗中的重要性。此外，对神经细胞氧化应激和凋亡相关通路的干预是糖尿病周围神经病变防治的重要策略，人参皂苷Rb1可通过减轻雪旺细胞的DNA氧化损伤、减少凋亡而有助于DPN的防治。

参考文献：

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[9]Tsai CC,Lu MC,Chen YS,et al.Locally administered nerve growth factor suppresses ginsenoside Rb1-enhanced peripheral nerve regeneration[J].Am J Chinese Med,2003,31(5):665-673.

[10]Huang F,Li YN,Yin F,et al.Ginsenoside Rb1 inhibits neuronal apoptosis and damage,enhances spinal aquaporin 4 expression and improves neurological deficits in rats with spinal cord ischemia-reperfusion injury[J].Mol Med Rep,2015,11(5):3565-3572.

Ginsenoside Rb1 inhibits apoptosis in Schwann cells induced by intermittent high glucose

XUE Bing1,LIANG Lin-lang1,SONG Wei1,SUN Lian-qing2*

(1.Department of Endocrinology,General Hospital of Shenyang Military Command，Shenyang 110016，China；2.Department of Traditional Chinese Medicine,the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University,Xi′an 710061,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of ginsenoside Rb1 on the apoptosis in Schwann cells induced by intermittent high glucose (IHG).MethodsSchwann cells were obtained and primarily cultured from the sciatic nerves of neonatal Sprague-Dawley rats.The cultured cells were treated for 48 h with 5.6 mmol/L glucose as control (Con group),or with 5.6 mmol/L and 50 mmol/L glucose alternating every 8 h to mimic IHG (IHG group),or with IHG plus 100 μmol/L ginsenoside Rb1 (IHG+Rb1 group).Apoptosis was detected by flow cytometry.Level of 8-hydroxy-2-deoxy guanosine (8-OHdG) was detected by enzyme linked immunosorbent assay.The mRNA expression of Bax and Bcl-2 was detected by quantitative real-time reverse transcription PCR.The protien expression of Bax and Bcl-2 was detected by Western blot.ResultsAs compared with Con group,the percentage of apoptotic cells and the level of 8-OHdG in IHG group were both increased (7.69 and 3.24 folds of control respectively，P<0.01).The mRNA and protein expression of Bax were up-regulated,while those of Bcl-2 were down-regulated in IHG group.Rb1 treatment inhibited the above effects induced by IHG.The percentage of apoptotic cells and the level of 8-OHdG in IHG+Rb1 group were decreased by 54.1% and 32.7 % respectively as compared with IHG group(P<0.05).The down-regulated mRNA and protein expression of Bax,and the up-regulated mRNA and protein expression of Bcl-2 were antagonized in IHG+Rb1 group as compared with IHG group.ConclusionGinsenoside Rb1 inhibits IHG-induced apoptosis in Schwann cells with certain neuroprotective effect

Key words：Ginsenoside Rb1;Schwann cell;Apoptosis

收稿日期：2016-02-10

基金项目：陕西省中医药管理局项目(13-LC088);陕西省自然科学基金(2014JM4118)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201606003