蒋晶晶，姚　鹏，田　悦，吴秀英，张　锦



·论著·

NRG1-ErbB2信号通路对骨癌痛大鼠脊髓胶质细胞及IL-1β的影响

蒋晶晶a*，姚鹏b，田悦a，吴秀英a，张锦a

中国医科大学附属盛京医院a.麻醉科，b.疼痛科，沈阳 110004

[摘要]目的探讨NRG1-ErbB2信号通路对骨癌痛大鼠脊髓胶质细胞和IL-1β的影响。方法雌性SD 大鼠，随机分为3组，每组12 只。Sham组(假手术组)；CIBP组：大鼠胫骨内注射Walker256乳腺癌细胞构建骨癌痛模型；CIBP+PD168393组：构建CIBP模型后6 d，鞘内注入PD168393 10 μg，每日1次，连续9 d，其余组鞘内注入生理盐水。接种瘤细胞后14 d，检测大鼠脊髓背角GFAP、OX42和IL-1β的变化。结果接种瘤细胞后14 d,CIBP组大鼠GFAP、OX42积分光密度值明显高于Sham组，差异有统计学意义(P<0.01)，肿瘤细胞的植入能诱导大鼠同侧脊髓背角GFAP和OX42的表达显著增加，并使星形胶质细胞和小胶质细胞的胞体肥大。而给予ErbB2受体抑制剂PD168393可明显抑制脊髓背角神经化学物质的改变，GFAP和OX42的表达均明显降低(P<0.01)。CIBP组IL-1β于接种瘤细胞后14 d表达增加，明显高于Sham组(P<0.01)，给予PD168393能显著抑制IL-1β表达增加(P<0.01)。结论大鼠胫骨接种瘤细胞后，脊髓背角内星形胶质细胞和小胶质细胞被广泛激活，IL-1β释放增加，阻断NRG1-ErbB2受体信号通路能有效抑制脊髓胶质细胞的表达和活化及炎症介质IL-1β的释放，从而产生镇痛作用。

[关键词]骨癌痛；NRG1；ErbB2；脊髓；胶质细胞；鞘内注射；痛觉过敏

0引言

神经调节因子(Neuregulin1,NRG1)属于表皮生长因子类蛋白，在多种组织中都有表达。NRG1通过与表皮生长因子受体ErbB3或ErbB4结合，介导ErbB2受体的活化，两者形成异源性二聚体,激活酪氨酸激酶，诱导广泛的生物学功能。NRG1-ErbB2信号通路在神经系统和心脏发育中具有重要的调节作用[1]，调节突触信号的传递和突触的可塑性[2-3]，介导细胞的存活、增殖、分化和迁移[4]。突触可塑性变化是中枢敏化的基础，而中枢敏化又是疼痛产生的主要原因之一。近年研究发现，胶质细胞上表达ErbB2、ErbB3和ErbB4受体[5-7]，外周神经损伤时初级传入中枢表达NRG1增加[8]，同时脊髓背角小胶质细胞增殖和活化导致痛觉过敏[9-10]。但NRG1-ErbB2信号通路是否也参与了骨癌痛(Cancer-induced bone pain，CIBP)中脊髓胶质细胞的活化，目前尚不清楚。本研究通过大鼠胫骨注射Walker256乳腺癌细胞建立大鼠骨癌痛模型，旨在探讨骨癌痛中NRG1-ErbB2信号通路的作用及机制，从而为寻找新的有效的治疗骨癌痛的方法奠定基础。

1材料与方法

1.1主要仪器和试剂PD168393(美国Calbiochem公司)，鼠抗GFAP抗体(美国Sigma公司)，鼠抗OX42抗体(美国Abcam公司)，IL-1β ELISA试剂盒(美国R&D公司)，PE10导管(宁波市安来软件科技有限公司)。

1.2实验动物与分组雌性SD大鼠，体重200～220 g，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供，饲养于铺垫锯末塑料盒内，每笼5 只，室内温度22～24 ℃，湿度40%～60%，自然照明，自由摄食、饮水。实验获得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会的批准。雌性SD 大鼠，随机分为3组，每组12 只。Sham组(假手术组)；CIBP组：大鼠胫骨内注射Walker256乳腺癌细胞构建骨癌痛模型；CIBP+PD168393组：接种瘤细胞后第4天进行鞘内置管，第6天鞘内注入PD168393 10 μg(5%DMSO稀释，1 μg/μL,10 μL)，每日1次，连续9 d；其余组鞘内注入生理盐水。第14天取出L4-6节段脊髓，检测大鼠脊髓背角星形胶质细胞标记物胶质细胞纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)、小胶质细胞标记物(OX-42)和IL-1β的变化。

1.3大鼠胫骨癌痛模型建立选用体重200～220 g的雌性SD大鼠，10%水合氯醛300 mg/kg腹腔内麻醉后，在右侧后肢胫骨中上1/3处将皮肤切开约1 cm 小口，小心暴露胫骨，先用2 mL 注射器针头在胫骨钻孔，用25 μL微量注射器经针孔进入骨髓腔，缓慢注入Walker256的PBS 细胞悬液10 μL，共含癌细胞1×105个，2 min内注射完毕，注射后迅速用骨蜡封住针孔，无菌生理盐水冲洗切口，皮肤分层缝合，在伤口处涂金霉素眼膏，整个手术过程均按照无菌要求进行[11]。CIBP组、CIBP+PD168393组注入Walker256肿瘤细胞；Sham组大鼠右侧胫骨上段注入等体积的灭活细胞，其余操作同CIBP组、CIBP+PD168393组。

1.4大鼠蛛网膜下腔置管参考姚鹏等[12]的方法：大鼠蛛网膜下腔置管，于L3-4椎间隙置入PE10导管，至脊髓腰膨大水平处(置管深度约2 cm)[13]。取无感觉和运动障碍的大鼠，于置管后第2天经鞘内给予20 g/L利多卡因20 μL判断鞘内置管是否成功，若注药后30 s内大鼠出现双后肢麻痹现象，表明导管位置正确。

1.5免疫组织化学各组动物在各个时间点经腹腔注射麻醉后，开胸经左心室至升主动脉插管，先以100 mL PBS冲洗,应用含4%多聚甲醛的PBS 250 mL 灌注固定。取L4-6节段脊髓,置于4%多聚甲醛溶液中固定，4 ℃过夜,次日，将标本转入30%的蔗糖溶液中，脱水至组织沉底。做冠状切片,片厚10 μm。收集切片于0.01 mmol/L的PBS 中，应用漂片法进行免疫组织化学实验，使用生物素标记的羊抗鼠IgG、鼠抗GFAP 及OX42(1∶500),分别检测GFAP 和OX42 的染色情况。每只大鼠选择5张非连续染色切片扫描图像，应用Meta Morph图像分析系统软件进行光密度测定,并以无阳性产物处光密度为背景值以获得校正光密度值。

1.6ELISA法检测IL-1β的分泌冰上取大鼠L4-6节段脊髓组织，匀浆后行总蛋白测定，按试剂盒的说明检测各组IL-1β的含量，酶标仪测定其吸光度值，绘制标准曲线，并计算各样品的浓度值。

2结果

2.1大鼠脊髓背角GFAP、OX42的变化CIBP组大鼠接种瘤细胞后14 d，术侧腰段脊髓背角可见大量GFAP阳性星形胶质细胞(染色加深，胞体增大，突起变粗变长)和OX42染色的小胶质细胞(染色加深，胞体显著肥大，突起变粗变短)数量明显增多，在脊髓灰质的任何部位都可观察到GFAP和OX42增多，但在脊髓背角浅层Ⅰ～Ⅱ层增加得更为明显。Sham组大鼠术侧腰段脊髓背角仅见少量GFAP、OX42阳性星形胶质细胞和小胶质细胞(胞体小、突起细)。CIBP组大鼠术侧腰段脊髓背角GFAP、OX42积分光密度值明显高于Sham组，差异有统计学意义(P<0.01)。而PD168393组的脊髓背角胶质细胞明显受到抑制，GFAP和OX42的表达均显著降低，见图1、图2及表1。

图1　各组手术同侧脊髓GFAP的变化(n=6，Scale bar=50 μm)

图2　各组手术同侧脊髓OX42的变化(n=6，Scale bar=50 μm)

表1　脊髓背角GFAP和OX42的表达情况

注：与Sham组比较，**P<0.01；与CIBP 组比较，##P<0.01

2.2脊髓组织中IL-1β表达的变化接种瘤细胞后14 d，Sham组脊髓组织中IL-1β有少量表达。与Sham组比较，CIBP组大鼠脊髓组织中的IL-1β表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。给予ErbB2受体抑制剂PD168393预处理，能显著抑制肿瘤细胞诱导的IL-1β表达增加，见图3。

图3　各组大鼠脊髓组织中IL-1β表达水平的变化(n=6)

3讨论

癌症患者常常伴有中到重度的疼痛，尤其是晚期癌症的患者，约75%～95%会发生难以控制的慢性疼痛，骨癌痛是肿瘤引起的慢性疼痛中最为常见的一种[14]，很多常见的肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌容易转移至机体的多处骨骼，引起疼痛。骨癌痛的机制复杂，存在痛觉敏化现象，即骨癌痛模型中肢体表现出痛阈降低、痛觉过敏和接触诱发痛等疼痛相关行为。研究表明，肿瘤刺激下初级传入神经末梢能释放出一系列生长因子、细胞因子和化学因子，如兴奋性氨基酸、缓激肽、前列腺素、钙基因相关肽、P物质和酪氨酸激酶等。这些因子作用于中枢脊髓背角胶质细胞，并使之发生活化反应。激活后的胶质细胞通过释放多种神经活性物质，直接影响神经元可塑性，促进初级传入末梢伤害性神经递质的释放，改变周围的神经化学环境，促进疼痛的外周与中枢敏化[15]。

本实验前期研究显示，大鼠胫骨注射Walker256 瘤细胞诱发的骨癌痛模型中，脊髓背角NRG1和ErbB2的表达从术后第6天起呈时间依赖性显著增多，同时大鼠机械性痛阈明显降低、热辐射潜伏期显著缩短，给予外源性ErbB2受体抑制剂PD168393，能有效缓解大鼠因肿瘤细胞植入而产生的痛敏行为，证明NRG1-ErbB2信号通路与骨癌痛的产生和维持有关[16]。本实验通过应用ErbB2受体抑制剂PD168393来阻断NRG1-ErbB2信号通路，发现大鼠胫骨注射Walker256细胞造模后，术侧腰段脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞均被广泛激活，接种肿瘤细胞后14 d，GFAP和OX42染色阳性细胞数明显增多，染色加深，突起显著增多，IL-1β表达显著增加。PD168393能显著抑制肿瘤细胞导致的脊髓背角GFAP和OX42的改变，降低 IL-1β的表达，表明阻断NRG1-ErbB2受体信号通路能有效抑制脊髓中胶质细胞的表达和活化，抑制炎症介质IL-1β的释放，从而产生镇痛作用。因此推测，大鼠胫骨接种肿瘤细胞后，初级传入中枢表达NRG1增加，星形胶质细胞和小胶质细胞上的ErbB2受体被激活，NRG1信号通过ErbB2受体引起星形胶质细胞和小胶质细胞增殖和活化，促使炎症介质IL-1β大量释放，这些炎症介质又激活星形胶质细胞和小胶质细胞，导致痛敏的持续发生。

综上所述，NRG1-ErbB2信号通路促进脊髓胶质细胞的活化，参与骨癌痛的发病机制，抑制NRG1-ErbB2信号通路将成为骨癌痛治疗的新靶点。

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Effect of NRG1-ErbB2 signaling pathway on spinal cord glia and IL-1β of rats with cancer-induced bone pain

JIANG Jing-jinga*,YAO Pengb,TIAN Yuea,WU Xiu-yinga,ZHANG Jina

(a.Department of Anesthesiology,b.Department of Pain Management,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of neuregulin1 (NRG1)-ErbB2 signaling pathway on the expression of spinal cord glia and IL-1β in rats with cancer-induced bone pain (CIBP).MethodsFemale SD rats were randomly divided into three groups (12 rats in each group).Sham group:sham operation group.CIBP group:walker256 mammary gland carcinoma cell was inoculated into the tibia of rats.CIBP+PD168393 group:10 μg PD168393 was injected intrathecally once daily at 6 d after inoculation for 9 d.Intrathecal injection of saline was given in another groups.The expression of Glial fibrillary acidic protein(GFAP),OX42 and IL-1β was detected at 14 d after inoculation.ResultsThe mean optical density of OX42 and GFAP in CIBP group was higher than that of sham group at 14 d after inoculation (P<0.01).The inoculation of walker256 tumor cell could significantly increase the expression of GFAP and OX42 in ipsilateral spinal cord dorsal,make the astrocytes and microglia hypertrophy.The alterations were inhibited by PD168393,an ErbB2 receptor blocking agent,and the GFAP and OX42 expression decreased (P<0.01).The expression of IL-1β in CIBP group was higher than that of sham group at 14 d after inoculation(P<0.01),which was attenuated by PD168393.ConclusionTumor cell inoculation induces the activation of spinal astrocytes and microglia and promotes the release of IL-1β.Inhibiting NRG1-ErbB2 signaling pathway can reduce the CIBP by suppressing the activation of spinal glia and the expression of inflammatory cytokine IL-1β.

Key words：Cancer-induced bone pain;NRG1;ErbB2;Spinal cord;Glia;Intrathecal injection;Hyperalgesia

收稿日期：2016-03-15

基金项目：国家自然科学基金(81500958)；辽宁省科学技术计划项目(2012225016)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201606001