李　军，孙玉坤，孙云峰，刘　丽，范　颖，张立德



HPLC同时测定龙须草中2个菲类化合物的含量

李军1,2，孙玉坤3，孙云峰1,2，刘丽1,2，范颖1,2，张立德2*

1.辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110032；2.辽

[摘要]目的建立HPLC法测定龙须草中的厄弗酚和去氢厄弗酚含量。方法采用色谱柱：Waters symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：25 ℃。结果厄弗酚进样量为1.92～48.00 μg (r=0.999 5)、去氢厄弗酚进样量为4.13～103.25 μg (r=0.999 3)时线性关系良好，两者的平均回收率分别为100.06% (RSD=0.91%，n=6)、99.89% (RSD=1.35%，n=6)。结论本方法简便、快速、准确，适用于厄弗酚和去氢厄弗酚的含量测定，为龙须草药材的质量评价提供依据。

[关键词]龙须草；菲类化合物；灯芯草科；厄弗酚；去氢厄弗酚

0引言

龙须草(JuncussetchuensisBuchen.)又称野灯芯草、水通草，为灯心草科(Juncaceae)灯心草属的植物，多年生草本，广泛分布于我国的江苏、山东、安徽、浙江、江西、福建、河南、广东、湖南、四川、贵州、云南、西藏等省区，资源十分丰富[1]。龙须草以其干燥的茎髓入药，具有清心火、利小便的功效，可用于小便不利、尿道刺痛、口舌生疮、水肿、心烦不寐等症[2]。化学成分研究表明，龙须草中主要含有菲类、二氢菲类、黄酮类、甾体等成分，其中以菲类、二氢菲类化合物为主要成分[3-5]。国内外研究学者发现，灯心草属植物中的菲类化合物具有抗菌、抗焦虑、抗肿瘤、抗氧化、镇静等活性[6-8]。本研究采用HPLC技术，建立了同时测定中药龙须草所含的厄弗酚和去氢厄弗酚2种菲类成分的分析方法，此方法简便、快捷、准确，为中药龙须草的质量控制提供了依据。

1仪器与试药

1.1仪器日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪，二元泵系统，SPD-20A紫外检测器；美国MILLIPORE SIMS50000 超纯净水器；KQ-100b型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TD-25电子分析天平(丹佛仪器北京有限公司，十万分之一)；SF-130B高速粉碎机(上海冠联制药仪器有限公司)，鼓风恒温干燥箱(上海精宏仪器设备有限公司)。

1.2试药厄弗酚和去氢厄弗酚对照品(本实验室分离纯化，经UV、NMR、MS、IR 鉴定，HPLC 纯度不低于98%，符合定量要求)；龙须草药材采自7个不同产地，分别为江西省的南昌、上饶、景德镇、九江、鹰潭，安徽省的黄山、铜陵，以上产地龙须草药材经鉴定均为灯心草植物龙须草JuncussetchuensisBuchen.的干燥茎髓；高效液相色谱用水为MILLIPORE超纯水机制备超纯水，甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Waters symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。甲醇为流动相A，0.1%甲酸水溶液为流动相B。梯度洗脱：0～10 min，30%～30%A；10～35 min，30%～50% A；35～45 min，50%～50% A。记录对照品溶液、样品溶液的色谱图,见图1。

图1　HPLC色谱图

2.2供试品溶液制备取龙须草药材适量，粉碎，取1.0 g，精密称定，置于具塞三角烧瓶内，精密加入40 mL甲醇，称定重量并记录后，超声处理30 min (250 W，40 kHz)，取出，放至室温，再称重，用甲醇补充损失的重量，充分摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液，备用。

2.3对照品溶液制备精密称定厄弗酚(0.019 2 g)和去氢厄弗酚(0.041 3 g)置于50 mL容量瓶中，加甲醇充分溶解并稀释至刻度线后，溶解摇匀；精密吸取1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度线，摇匀，配成质量浓度分别为38.4、82.6 μg/mL的对照品溶液，备用。

2.4线性关系考察分别精密量取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，按照“2.1”项下色谱条件注入高效液相色谱仪，测定峰面积值，以进样量(μg)为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得2种成分的回归方程：Y=83 123 X-166 512，r=0.999 5，表明厄弗酚在0.038 4～0.96 μg与峰面积呈良好线性关系；Y=221 607 X+607 284，r=0.999 3，表明去氢厄弗酚在0.082 6～2.065 μg与峰面积呈良好线性关系。

2.5精密度试验取混合对照品溶液20 μL，在“2.1”项色谱条件下，重复进样6次，记录峰面积。厄弗酚和去氢厄弗酚峰面积的RSD值为1.12%和0.87%，表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验取同一份供试品溶液分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定峰面积，结果厄弗酚和去氢厄弗酚峰面积的RSD值分别为0.98%和0.56%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7重复性试验取同一产地(江西南昌)样品，按“2.2”项下方法平行处理，制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件取供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪进行分析。厄弗酚和去氢厄弗酚质量分数的RSD分别为1.37%、1.05%，表明本方法重复性良好。

2.8加样回收率试验取含量已知的样品(江西南昌) 6份，粉碎，分别取1.0 g，精密称定，置于具塞三角烧瓶内，分别加入厄弗酚和去氢厄弗酚对照品适量，按“2.2”项方法处理，制备供试品溶液。测得厄弗酚的平均回收率为100.06%(n=6)，RSD=0.91%；去氢厄弗酚的平均回收率为99.89%(n=6)，RSD=1.35%。见表1。

2.9样品的测定取采自江西和安徽不同地区的7批样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样20 μL，记录峰面积，分别计算厄弗酚和去氢厄弗酚的含量。见表2。

3讨论

3.1提取方法的选择在溶剂的选择上，本研究分别采用氯仿、丙酮、甲醇及乙醇，在提取方法上采用加热回流、超声和索式提取，并选择不同提取时间(10、20、30、40、60 min)进行比较。结果表明，甲醇超声提取30 min的提取效果最优。

3.2流动相系统选择本研究分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-水的等度和梯度洗脱，结果表明，用甲醇-0.1%甲酸梯度洗脱，2种成分均能与杂质达到较好的分离效果。

表1　厄弗酚和去氢厄弗酚加样回收试验结果

表2　不同产地龙须草中厄弗酚和去氢厄弗酚

3.3检测波长的选择在上述液相色谱条件下，以光电二极管阵列检测器对厄弗酚和去氢厄弗酚的对照品混合溶液，于波长200～400 nm绘制成三维图谱，结果厄弗酚和去氢厄弗酚2个对照品分别在272、262 nm波长处有最大吸收峰，同时为了兼顾与龙须草中其他成分的分离度符合要求，故选择260 nm为检测波长。

厄弗酚和去氢厄弗酚是药用植物龙须草中所含的典型菲类化合物，其含量也较高，并且在药理学实验中表现出多种活性，所以，上述2个化合物非常适合作为龙须草药材质量控制的标准品。菲类化合物由于自身特殊的芳香共轭结构，其紫外吸收强，很适合用紫外检测器来测定含量[9-10]；另外，有文献报道，通过核磁共振技术(NMR)[11]和液质联用技术(HPLC-MSn)[2]检测中药所含的菲类成分，但是，这两种测试手段操作相对繁琐、仪器要求高、价格昂贵，不适合广泛应用。

综上所述，本实验所建立的方法能够快速、准确、简便地测定龙须草中厄弗酚和去氢厄弗酚的含量，此方法所提供的客观指标为龙须草药材的质量评价提供了应用依据。

参考文献：

[1]蔡鹰,陆瑜,吴玉兰,等.龙须草化学成分研究[J].中药材,2014,37(4):602-604.

[2]赵丹丹,李贵云,王小红,等.灯心草及野灯心草中菲类成分的LC-ESI-MS快速识别及鉴定[J].中草药,2013,44(12):1539-1545.

[3]李军,时圣明,孙玉坤,等.龙须草中1个新的二氢菲类化合物[J].中草药,2015,46(16):2361-2364.

[4]Wang J,Liu J,Wen QF,et al.Chemical constituents from the aerial parts of Juncus setchuensis[J].Biochem Syst Ecol,2010,38(5):1039-1041.

[5]Wang XY,Ke CQ,Tang CP,et al.9,10-Dihydrophenanthrenes and phenanthrenes from Juncus setchuensis[J].J Nat Prod,2009,72(6):1209-1212.

[6]Marina DG,Antonio F,Lorenzo M,et al.Cytotoxic 9,10-dihydrophenanthrenes from Juncus effusus L[J].Tetrahedron,1993,49(16):3425-3432.

[7]Katsuhito S,Masao T,Yoshinori A.Phenanthrene derivatives from the medullae of Juncus effusus[J].Phytochemistry,1991,30(9):3149-3151.

[8]Greca MD,Fiorentino A,Mangoni L,et al.9,10-Dihydrophenanthrene metabolites from Juncus effusus L[J].Tetrahedron Lett,1992,33(36):5257-5260.

[9]韩广轩,黄尊动,王麦莉,等.8种产地白及中两种菲类的含量比较[J].中国药师,2011,14(12):1744-1745.

[10]侯慧静,蔡仕宁,李瑞芳,等.UPLC法测定石仙桃中的两个二氢菲类化合物[J].华西药学杂志,2015,30(4):493-494.

[11]付茜,孙璐,王勤辉,等.野灯心草地上部分菲类化合物的研究[C].中华中医药学会第七次中药分析学术交流会论文集,2014:386-388.

Simultaneous content determination of two phenanthrene components inJuncussetchuensisby HPLC

LI Jun1,2,SUN Yu-kun3,SUN Yun-feng1,2,LIU Li1,2,FAN Ying1,2,ZHANG Li-de2*

(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;2.Key Laboratory of Ministry of Education for TCM Viscera-State Theory and Applications,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;3.Department of Pharmacy,Liaoning Provincial Crops Hospital,Chinese People′s Armed Police Force,Shenyang 110034,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish an HPLC method for the content determination of effusol and dehydroeffusol in Juncus setchuensis.MethodsThe Waters symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) column was used with methanol (A)-0.1% formic acid solution (B) gradient elution as the mobile phase,the flow rate was 1.0 mL/min,and the detection wavelength was at 260 nm with column temperature of 25 ℃.ResultsThe linear range of effusol and dehydroeffusol was 1.92～48.00 μg (r=0.999 5) and 4.13～103.25 μg (r=0.999 3),and the average recovery rates were 100.06% (RSD=0.91%,n=6) and 99.89% (RSD =1.35%,n=6).ConclusionThe established HPLC method is simple,rapid and reliable for the separation and simultaneous determination of effusol and dehydroeffusol,which provides a basis for quality evaluation for Juncus setchuensis as medicinal materials.

Key words：Juncus setchuensis;Phenanthrene;Juncaceae;Effusol;Dehydroeffusol

收稿日期：2015-10-30

基金项目：中国博士后科学基金面上资助项目(2015M570257)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201606025

宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室，沈阳 110032；3.武警辽宁省总队医院药剂科，沈阳 110034