曹　忻，邹云龙，蔡　勇，周　平，李　明，石国庆，康相涛*

(1.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002； 2.西北民族大学实验中心，兰州 730070；3.新疆农垦科学院畜牧所，石河子 832000)



绵羊卵母细胞体外成熟过程中VEGF对DNMT3a表达的影响

曹忻1，2，邹云龙2，蔡勇2，周平3，李明1，石国庆3，康相涛1*

(1.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002； 2.西北民族大学实验中心，兰州 730070；3.新疆农垦科学院畜牧所，石河子 832000)

摘要：旨在探究血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)在绵羊卵母细胞体外成熟过程中对DNMT3a的影响。本研究采用RNA干扰和显微注射技术将针对VEGF两个受体FLT1和KDR/Flk-1的有效干扰片段导入到绵羊卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocytescomplexes，COCs)中，检测体外成熟培养各时间卵母细胞和颗粒细胞中DNMT3amRNA和蛋白表达水平的变化。结果表明，COCs体外成熟培养过程中，无论是否添加VEGF，卵母细胞内DNMT3amRNA表达量都随着培养时间延续而降低，培养至8h时DNMT3amRNA表达量急速下降，之后下降速度放缓，至24h后各组趋于一致，且未注射干扰片段对照组的下降速度快于其他干扰组(P<0.01)。添加VEGF组DNMT3amRNA表达量的下降速度快于未添加组。干扰片段导入后发现，FLT1-siRNA和KDR-siRNA复合干扰组干扰效果优于KDR-siRNA干扰组，FLT1-siRNA干扰组干扰效果最弱(P<0.01)。无论是否添加VEGF，在COCs体外成熟培养过程中，颗粒细胞DNMT3amRNA表达量都随着培养时间延续而降低，且各组表达量差别不大。其中未注射干扰片段对照组的下降速度在COCs成熟培养中期快于其他干扰组(P<0.05或P<0.01)，FLT1-siRNA干扰效果较好。无论是否添加VEGF卵母细胞内DNMT3a蛋白表达量从0～4h上升，之后匀速下降，至16h急速下降，24h为零。未导入干扰片段对照组下降速度最快。其中16h对照组、FLT1-siRNA干扰组、KDR-siRNA干扰组和FLT1-siRNA&KDR-siRNA复合干扰组DNMT3a蛋白表达量，添加VEGF后，分别下降到培养初期的23.12%、31.07%、41.47%和37.90%，未添加VEGF的组则分别下降到培养初期的37.38%、54.60%、57.58%和82.75%。颗粒细胞中，添加VEGF组DNMT3a蛋白表达量呈现逐渐下降趋势，至20h时，已无DNMT3a蛋白表达；未添加VEGF组从0～4h有略微上升，之后呈现逐渐均速下降趋势，20h时，急速下降，至24h时，无DNMT3a蛋白表达，且干扰片段对DNMT3a蛋白表达影响不大，而本身颗粒细胞中DNMT3a蛋白表达量也不高。结果提示，绵羊COCs体外成熟培养过程中，VEGF加快了卵母细胞中DNMT3amRNA和蛋白表达量的下降速度。而干扰片段的导入则使DNMT3amRNA和蛋白表达量下降速度放缓；颗粒细胞内VEGF的添加和受体干扰片段的导入，对DNMT3amRNA和蛋白表达影响效果不明显。

关键词：血管内皮生长因子；DNMT3a；卵母细胞；绵羊；体外培养

血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是一种促进内皮细胞增生、迁徙，抑制细胞凋亡，提高血管和微血管对大分子物质通透性的生长因子[1-2]，其研究多集中在人类医学，而关于动物方面的研究报道很少[3-4]。DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)保证基因印迹的建立和维持，DNMT的缺失或功能异常导致基因印迹的异常，这将严重阻碍胚胎的正常发育[5-6]。DNMT3a在细胞的生长和调亡中可以起到一定作用，能与P53直接作用而抑制P21的转录从而解除P21对细胞增殖的抑制作用[7]。……