西安交通大学第一附属医院(西安710061)　李福广　徐　军



姜黄素对原发性肝癌组织中肝星状细胞活性影响的实验研究*

西安交通大学第一附属医院(西安710061)李福广徐军

摘要目的：探索姜黄素对肝星状细胞增殖、侵袭能力及相关分子表达的影响。方法：取新切取的肝细胞癌组织,利用组织消化分离培养法,提取活化状态的肝星状细胞,鉴定细胞类型、评估细胞活性及纯度。对新鲜提取的肝星状细胞,经不同浓度的姜黄素干预后用MTT法检测细胞增殖,用Transwell实验检测姜黄素对肝癌相关肝星状细胞侵袭能力的影响。分别提取细胞总mRNA及总蛋白,运用Realtime-PCR检测姜黄素对肝癌相关肝星状细胞侵袭相关分子(MMP-2、TIMP-1、I 型胶原、层粘连蛋白)表达影响。结果：姜黄素可以抑制肝细胞癌相关肝星状细胞的增殖,并呈现浓度及时间依赖效应；姜黄素处理可以降低肝细胞癌相关肝星状细胞侵袭能力；姜黄素可以下调肝细胞癌相关肝星状细胞侵袭相关分子MMP-2、I 型胶原的表达,上调TIMP-1、层粘连蛋白的表达。结论：姜黄素可以抑制肝细胞癌相关肝星状细胞的增殖,并降低其侵袭能力,该作用可能与调控侵袭相关分子MMP-2、TIMP-1、I 型胶原、层粘连蛋白等的表达有关。

主题词姜黄素癌,肝细胞细胞增殖@肝星状细胞

我国是世界上原发性肝癌高发地区之一,肝癌标化发病率是25.7/10万,为仅次于肺癌、胃癌的最常见恶性肿瘤[1]。间质化是原发性肝细胞癌重要特征，肿瘤微环境在肝癌的发生、发展过程中发挥重要作用。肝星状细胞(HSC)是肝细胞癌微环境中的重要组分,研究证实肝星状细胞高度参与肝细胞癌的起源、发生、发展、转移过程,是肝细胞癌细胞外基质的重要来源[2]。姜黄素是从天然植物姜科、天南星科等中提取的一种多酚类化学物质,近年来研究表明,姜黄素是一种优良的抗肿瘤药物[3]。研究证实其与纤维化肝组织内肝星状细胞活性相关,但姜黄素对肝细胞癌相关性星状细胞的作用尚不清楚。本研究拟探索姜黄素对肝细胞癌相关性星状细胞增殖、侵袭能力的影响及其可能机制，从而为姜黄素用于肝癌的治疗提供依据。

材料和方法

1材料本实验所用原代肝星状细胞(HSC)从西安交通大学第一附属医院肝胆外科手术切除的肝癌组织标本中分离提取。标本获取前获得患者许可,并经我院伦理委员会批准。切取1.0～1.5 g肝癌组织,立即放置于4℃无菌的含有青霉素和链霉素的Hanks平衡盐中,于无菌操作台,在37 ℃含10 %胎牛血清的DMEM培养基中剪刀剪碎肝细胞癌组织至极微小的碎片组织,利用无菌PBS漂洗3次肝癌碎片组织后置于含0.05 %胶原酶P、0.02 %链霉蛋白酶以及0.1 %DNA酶的Gey平衡盐消化液(GBSS)中,于37 ℃水浴振荡45 min,以从肝癌碎片组织中分离HSC。DMEM高糖培养基、胎牛血清为澳大利亚Hyclone公司产品。四甲基偶氮唑盐MTT、青霉素、链霉素、盐霉素为Sigma公司产品；Trizol购自美国Invitrogen 公司；逆转录试剂盒及Realtime PCR试剂盒购自大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司；所需引物由上海生物工程技术服务有限公司负责设计合成；兔抗鼠MMP-2、兔抗β-actin及兔抗TIMP-1购自美国Santa Cruz公司；鼠抗I 型胶原、鼠抗层粘连蛋白、鼠抗GFAP及鼠抗α-SMA抗体购自美国Cell signaling公司；山羊抗兔及山羊抗鼠二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。Transwell小室购自美国Corning公司；RIPA蛋白裂解液购自上海申能博彩生物科技公司。

2细胞培养原代HSC含10 %胎牛血清的DMEM高糖培养基(含青霉素、链霉素各100 ng/ml)培养于37 ℃含5 %CO2的培养箱中常规培养,用0.25 %的胰酶消化传代,选用处于对数生长期的细胞用于所有实验。

3MTT法检测细胞增殖抑制率取对数生长期的HSC制成细胞悬液,以每孔5×103个细胞于96孔板中接种HSC,待细胞贴壁后,加0.1 %FBS的DMEM培养基过夜饥饿处理。将饥饿后的HSC设立6个平行实验孔,分别给以0 μM、5 μM、10 μM、20 μM、40 μM等浓度的姜黄素进行干预,干预后继续培养0 h、12 h、24 h、48 h、72 h。上述干预时间点到底后,每孔加入MTT溶液10 μl(浓度5 mg/ml),继续于培养箱中培养4 h后弃去上清,每孔再加入DMSO溶液200 μl,当出现蓝紫色颗粒结晶并充分溶解后,检测OD(490 nm)值。实验重复3次。按下列公式计算各实验组细胞增殖率：细胞增殖率=1-(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100%。以OD值为纵轴，时间为横轴，绘制细胞生长曲线图。

4划痕实验检测细胞迁移能力取2代以内的HSC种植到6孔板,分别给予0 μM、10 μM、20 μM的姜黄素进行干预48 h后,收集细胞，无血清培养基重悬单细胞，取8×104个细胞种植到包被有基质胶的Transwell小室内，下室为700 μl含20 %胎牛血清的培养基。放培养箱36 h后,固定染色,擦拭膜上细胞，随机取10个视野，应用Nikan摄像系统200倍镜下照相并计数。以穿过基质胶的下室细胞数作为观察指标。

5Realtime-PCR检测相关基因的mRNA表达将0 μM、10 μM及20 μM姜黄素干预24 h后的HSC按Trizol法提取细胞总RNA。用Taka逆转录试剂盒进行逆转录操作，得到的cDNA用于Real-time-PCR扩增。PCR反应体系为20 μl，其中含有：2 μl逆转录产物(cDNA),上游与下游引物各1 μl,2×SYBY green PCR Master 10 μl,用ddH2O水补足体积至20μl。PCR反应条件如下：95℃预变性5 min；95℃变性30 s,58 ℃退火30 s,74℃延伸30 min,共40个循环；74℃延伸10 min以终止反应。以GAPDH作为内参照,每组设置3个复孔。Realtime PCR反应完成后,待测基因的表达水平通过△△CT计算方法进行定量表达。△△CT =实验组(CT目的基因- CTGAPDH)-对照组(CT目的基因-CTGAPDH)。扩增用目的基因引物见表1。

附表　引物设计序列

结果

1肝星状细胞的提取与鉴定本实验成功提取到肝细胞癌组织内的肝星状细胞。在倒置光学显微镜下,观察到由肝癌组织内提取、培养后第1天的肝星状细胞呈多样的星形状(见图1 A、B),提取后第1天行台盼蓝拒染实验证实细胞活力达85 %以上。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是肝癌组织内肝星状细胞的特有成分,常作为肝星状细胞的鉴定标志物；平滑肌肌动蛋白(a-SMA)则是活化的肝星状细胞的关键标志,它的高表达常常提示肝星状细胞具有活化表型[4]。对提取后第1～2天的肝星状细胞行GFAP、a-SMA的免疫荧光实验,证实由上述实验方法提取的细胞为本实验需要的活化状态的肝星状细胞(见图1 C、D)。后续的实验,我们选取经过2～3次传代培养的肝星状细胞进行药物干预。

A、B：光镜下,由肝癌组织中提取后第1天的肝星状细胞(A图放大倍数5×,B图放大倍数20×)；C：提取后第1 天肝星状细胞GFAP的免疫荧光图(放大倍数20×)；D提取后第1天肝星状细胞a-SMA的免疫荧光图(放大倍数20×)

图1肝星状细胞的提取与鉴定

2姜黄素抑制肝星状细胞的增殖将含有不同终浓度(0 μM、5 μM、10 μM、20 μM、40 μM)姜黄素的培养基分别干预融合度为30 % ～ 40 %的HSC至不同的时间点(12 h、24 h、48 h、72 h),采用MTT法评估姜黄素对肝星状细胞增殖性的影响见附表。与0 μM对照组相比,姜黄素在5～40μmol/L浓度范围内对HCS增殖能力均具有一定的抑制作用,呈现一定的浓度依耐性和时间依耐性。相比对照组，5 μM组可抑制HSC增殖,但强度并不大,连续干预72 h,抑制率仅(16.41±2.14)%；40 μM组则可明显抑制其的增殖,干预48 h后抑制率即可达(36.72±2.26)%,同时,注意到相比20 μM组,40 μM组对肝星状细胞增殖的抑制率提升并不明显，此结果提示随着姜黄素干预浓度的提高，其对HSC的抑制效率提升潜力下降，浓度依耐性特点逐渐消失。

3姜黄素抑制肝星状细胞的侵袭见图2。与0 μM的对照组相比,在给予10 μM、20 μM 姜黄素干预48 h后肝星状细胞的侵袭能力明显增强(P< 0.05),且20 μM的姜黄素干预浓度较10 μM抑制作用更为明显(P< 0.05),提示姜黄素对肝星状细胞侵袭性的抑制作用具有浓度依耐性。由于此实验是在无血清培养基中进行的,故可有效排除肝星状细胞增殖所产生的干扰。

附表　姜黄素对肝星状细胞增殖的影响±s,n=3)

注：各组时间点与0 μM组比较，*P<0.05

与0 μM组比较,*P<0.05

A：姜黄素干预48h后肝星状细胞Tanswell实验的代表性图；B：细胞侵袭实验的统计分析结果,姜黄素对肝星状细胞侵袭相关分子表达的影响

图2姜黄素对肝星状细胞侵袭性的影响

4姜黄素对肝星状细胞侵袭相关蛋白表达的影响将肝星状细胞种植到6孔板，分别给予0 μM、10 μM、20 μM的姜黄素进行干预36 h后，收集细胞，提取姜黄素干预后肝星状细胞的总mRNA。通过Realtime-PCR(RT-PCR)技术检测肝星状细胞内侵袭相关基因(MMP-2、TIMP-1、I 型胶原及层粘连蛋白)的变化见图3。结果显示,姜黄素干预36 h后，相比0 μM对照组,10 μM组、20 μM组肝星状细胞细胞内MMP-2及I 型胶原mRNA的表达水平明显下调，TIMP-1及层粘连蛋白的mRNA水平明显升高,且20 μM组的变化更为明显,提示姜黄素对肝星状细胞内侵袭相关基因表达水平的调节具有浓度依耐性。姜黄素干预48 h后,收集细胞并提取细胞总蛋白用于Western blot分析。与PCR检测结果一致,姜黄素干预可以显著降低肝星状细胞MMP-2、I 型胶原蛋白的表达水平,并提高TIMP-1、层粘连蛋白的表达，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。以上实验结果说明姜黄素抑制肝星状细胞的侵袭能力可能是通过抑制侵袭相关基因MMP-2、I 型胶原的表达以及提高TIMP-1、层粘连蛋白的表达而实现的。

与0μM组比较,*P<0.05,** P<0.01

讨论

近年来的研究证实肝星状细胞通过合成分泌细胞因子、趋化因子、生长因子与ECM组分,高度参与肝细胞癌的起源、发生、发展、转移过程[5]。Amann等[6]研究显示,活化的肝星状细胞还可以通过高表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1等促进肝癌生长。本实验通过组织消化培养法提取了肝细胞癌组织内活化的HSC,经流式细胞术检测分析提示新鲜提取的细胞纯度达到75%～85%，台盼蓝拒染实验证实细胞活力达85%以上,以此应用于后续的实验研究。

由于植物药的易获取性、用药安全性等因素,其抗癌作用越来越受到重视,姜黄素即为其中的典型代表,具有发展为临床化疗药的潜力,近年来已有大量研究聚焦于姜黄素对肝细胞癌的抗肿瘤作用及其机制[7]。肝星状细胞为肝细胞癌组织内尤为关键的间质成分,同时也为肝纤维化、肝硬化逐渐进展的核心促进因素。既往的研究结果提示姜黄素可抑制肝星状细胞的增殖，促进其凋亡[8]，然而姜黄素对肝癌细胞相关性星状细胞的影响及其分子机制研究却鲜有报道。本实验首先通过组织消化培养法，从新鲜切取的肝细胞癌组织内成功提取到活化的肝星状细胞。对新鲜提取的肝细胞癌相关肝星状细胞，分别给予不同终浓度姜黄素处理后发现，相较0 μM组，5 μM组、10 μM组、20 μM组、40 μM组的肝星状细胞增殖性均明显下降，并且呈一定的浓度依耐性和时间依耐性，以10 μM组、20 μM组的干预效率最佳。进一步利用Transwell实验发现，相较0 μM组，10 μM组、20 μM组的肝星状细胞侵袭性显著被抑制。既往已有大量研究证实MMP-2可显著提高HSC、肝癌细胞等的侵袭力，相反TIMP-1、层粘连蛋白则抑制HSC的侵袭转移能力。与此相吻合的是,本实验中，我们发现给予10 μM或者20 μM姜黄素处理后，比起0 μM处理组，肝星状细胞内MMP-2表达下调,而TIMP-1、层粘连蛋白表达上调。I 型胶原为肝星状细胞合成分泌的重要细胞外基质成分，本实验中我

们注意到,相较对照组,姜黄素干预组HSC合成分泌的I 型胶原蛋白明显增加；此实验结果,提示姜黄素同样可调节肝癌细胞组织内HSC合成分泌细胞外基质成分的功能,与姜黄素对肝纤维化、肝硬化组织内肝星状细胞发挥的作用保持一致。综上所述,本实验结果显示姜黄素可以抑制肝细胞癌相关肝星状细胞的增殖,并降低其侵袭能力,该作用可能与调控侵袭相关分子MMP-2、TIMP-1、I 型胶原、层粘连蛋白等的表达有关。

参考文献

[1] 高姗.上海市区原发性肝癌的流行病学研究[D].复旦大学,2011.

[2] Yang JD,Nakamura I,Roberts LR.The tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma: current status and therapeutic targets[J]. Semin Cancer Biol,2011,21(1)：35-43.

[3] 吴宏，闫国诚，王双全,等.姜黄素对胃癌细胞放疗增敏作用的研究[J].陕西医学杂志,2014,43(2)：137-139.

[4] Tacke F,Weiskirchen R.Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques[J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 2012,6(1):67-80.

[5] 郑旭锐,樊英华,韦永红,等.姜黄素对肝星状细胞JAK2-STAT3信号通路的影响[J].陕西中医,2013,34(9)： 151-152.

[6]Amann T,Bataille F,Spruss T,etal.Activated hepatic stellate cells promote tumorigenicity of hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Sci, 2009,100(4):646-653.

[7]苗久旺,张钦德.姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的信号途径研究进展[J].陕西中医,2014,35(12)：1692-1694.

[8]赵景润.姜黄素对肝星状细胞增殖与凋亡的影响的初步研究[D] .暨南大学,2004.

(收稿：2015-12-18)

【中图分类号】R737.5

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.06.003

*国家自然科学基金资助项目(30371398)