张建英，贾龙，张大治，喜巧红（.宁夏大学生命科学学院，宁夏银川7500；.宁夏大学农学院，宁夏银川7500）



从尖尾东鳖甲中提取甲壳素的研究

张建英1，贾龙2，张大治1，喜巧红1
（1.宁夏大学生命科学学院，宁夏银川750021；2.宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

摘要：通过单因素试验和正交试验探讨从尖尾东鳖甲（Anatolica mucronata Reitter，1889）中提取甲壳素的最佳条件，并对甲壳素样品进行定性和定量分析。试验结果表明：利用酸浸碱煮法提取甲壳素的最佳试验条件为：氢氧化钠浓度7%、温度87℃、时间5h、固液比1∶13（g/mL），柠檬酸浓度1.6g/L、室温、时间28h、固液比1∶9（g/mL）；对在最佳试验条件下提取得到的甲壳素样品进行红外光谱检测，并计算其得率为21.45%。用紫外吸收法和干法灰化法分别测定提取物中残余蛋白质和无机盐含量。

关键词：甲壳素；尖尾东鳖甲；最佳试验条件；提取；昆虫资源

尖尾东鳖甲（Anatolica mucronata Reitter，1889）隶属于鞘翅目拟步甲科，是蒙古高原的特有种，是我国北方的优势土壤昆虫，国内已知分布于内蒙古中西部、陕西北部、甘肃中北部和宁夏中北部，分布地区偏向蒙新区中部［1-2］。尖尾东鳖甲栖息于荒漠半荒漠草原，体色光亮，食性较杂，取食叶片、草根等。成虫通常喜气温大于15℃，地面温度大于18℃外出活动，且单独活动于沙面等较开阔地带，爬行速度快，活动范围大，活动高峰期集中于10：00-17：00，正午高温时，表现出短时背光现象［1-3］。虫体富含营养物质并具一定药用价值，特别是其防御腺分泌物有较强的化学毒性，具有重要医学价值。

甲壳素又名甲壳质、几丁质、蟹壳素等，广泛存在于低等动物，特别是节肢动物体内［4-6］，如：昆虫、甲壳动物等体内，它是一种天然的高分子多糖。由于甲壳素的化学结构和植物纤维素非常相似，且是自然界中唯一带正电荷的天然高分子聚合物，因此具备特殊的理化性质且天然无毒，被广泛应用于医药、农业、食品、化工、废水处理和生物工程等诸多领域中［5，7-8］。现今已引起了许多国家的重视，已成为最热门的研究领域之一［9］。目前，欧美学术界已称其为六大生命元素之一（蛋白质、脂质、糖类、维生素、矿质元素、甲壳素）［10-11］，现阶段工业上用来制备甲壳素的主要原料是水产加工场废弃的虾壳和蟹壳，但存在生产成本高，重金属难以脱除等限制问题。通过前人从蝇、蚕等一些虫种中提取甲壳素的研究发现，昆虫中甲壳素含量比较高，而且钙和重金属含量低，杂质少，纯度高，质量好，提取过程中对水、酸、碱消耗少，生产成本低。可见，昆虫甲壳素要优于虾、蟹甲壳素。因此，开发新的甲壳素资源具有重要的意义，而资源量大、种类多的昆虫正是潜在的甲壳素来源［5，8］。目前国内已有蚕蛹、蜣螂、蟋蟀等昆虫中甲壳素的提取报道［6，12］，但未有从尖尾东鳖甲中提取甲壳素的有关报道［1-2，13］。

1　材料与方法

1.1材料、仪器与试剂

1.1.1材料

尖尾东鳖甲成虫：采自宁夏灵武。

1.1.2仪器

电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A型）：上海一恒科技有限公司；电热恒温水浴锅（二列六孔）：北京长源实验设备厂；紫外可见分光光度计（T6）：北京普析通用仪器有限责任公司；电子分析天平（AL204）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；马弗炉（sx4-10）：深圳市中达电炉厂；红外光谱仪（TENSOR27）：德国布鲁克；低速台式离心机（KA-1000）：上海安亭科学仪器厂；pH计（320A）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.1.3化学试剂

氢氧化钠（分析纯）：天津市北联精细化学品开发有限公司；柠檬酸（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；标准甲壳素样品（C9752-250MG）：Sigma Aldrich；过氧化氢（30%）：北京化工厂；溴化钾（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2方法

1.2.1工艺流程

新鲜甲虫→预处理（除杂，烘干，粉碎）→脱除无机盐→水洗至中性→脱除蛋白质→水洗至中性→干燥→脱色［14］→甲壳素样品

1.2.2指标测定

测定脱除无机盐后样品的灰分，以确定脱除无机盐最佳试验条件；通过测定脱除蛋白质后样品的剩余蛋白质含量，以确定脱除蛋白质的最佳试验条件。总灰分/%=（恒重后坩埚和灰分重量－恒重后坩埚重量）/样品重量×100［15］；蛋白质含量/（μg/mL）=（1.45A280－0.74A260）×稀释倍数［16］，式中：A280、A260分别为蛋白质溶液在280、260 nm处测得的吸光度。

1.3单因素试验

1.3.1柠檬酸酸浸浓度的确定

称取5份尖尾东鳖甲干粉1.000 g，分别置于三角瓶中，在固液比1∶11（g/mL）、反应时间30 h、室温条件下，分别加入浓度为0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 g/L柠檬酸溶液，离心并将固体产物水洗至中性，干燥后得脱无机盐尖尾东鳖甲粉，测定产物灰分含量确定柠檬酸的最适浓度，重复3次。

1.3.2柠檬酸酸浸时间的确定

称取5份尖尾东鳖甲粉1.000 g，分别置于三角瓶中，在固液比1∶11（g/mL）、柠檬酸浓度1.4 g/L、室温条件下，恒温20、25、30、35、40 h，离心并将固体产物水洗至中性，干燥后得脱无机盐尖尾东鳖甲粉，测定产物灰分含量确定柠檬酸的酸浸的最适时间，重复3次。

1.3.3柠檬酸酸浸固液比的确定

称取5份尖尾东鳖甲粉1.000 g，分别置于三角瓶中，在柠檬酸浓度1.4 g/L、反应时间30 h、室温条件下，分别以固液比1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15（g/mL）加入柠檬酸溶液，离心并将固体产物水洗至中性，干燥后得脱无机盐尖尾东鳖甲粉，测定产物灰分含量确定柠檬酸的最适固液比，重复3次。

1.3.4氢氧化钠碱浸浓度的确定

称取5份尖尾东鳖甲粉1.000g，分别置于三角瓶中，在固液比1∶12（g/mL）、90℃水浴、恒温5 h条件下，分别加入4%、6%、8%、10%、12%氢氧化钠溶液，离心并将固体产物水洗至中性，得脱蛋白尖尾东鳖甲粉，测定产物蛋白质含量确定氢氧化钠的最适浓度，重复3次。

1.3.5氢氧化钠碱浸时间的确定

称取5份尖尾东鳖甲粉1.000 g，分别置于三角瓶中，在固液比1∶12（g/mL）、90℃水浴、浓度8%条件下，分别恒温1、3、5、7、9 h，离心并将固体产物水洗至中性，得脱蛋白尖尾东鳖甲粉，测定产物蛋白质含量确定氢氧化钠碱浸的最适时间，重复3次。

1.3.6氢氧化钠碱浸温度的确定

称取5份尖尾东鳖甲粉1.000 g，分别置于三角中，在固液比1∶12（g/mL）、恒温5 h、浓度8%条件下，分别置于80、85、90、95、100℃水浴锅中，离心并将固体产物水洗至中性，得脱蛋白尖尾东鳖甲粉，测定产物蛋白质含量确定氢氧化钠碱浸的最适温度，重复3次。

1.3.7氢氧化钠碱浸固液比的确定

称取5份尖尾东鳖甲粉1.000 g，分别置于三角瓶中，在90℃水浴、恒温5 h、浓度8%条件下，分别以固液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16（g/mL）加入氢氧化钠溶液，离心并将固体产物水洗至中性，得脱蛋白尖尾东鳖甲粉，测定产物蛋白质含量确定氢氧化钠的最适固液比，重复3次。

1.4正交试验

1.4.1柠檬酸脱除无机盐的正交试验设计

在单因素试验得到的最适柠檬酸浓度、酸浸时间、固液比的基础上，在室温条件下，选择柠檬酸浓度、酸浸时间、固液比3个因素为考察对象，设计三因素三水平正交试验对工艺条件进行优化。正交试验设计见表1。

表1　脱除无机盐的正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of demineralization orthogonal experiment

1.4.2氢氧化钠脱除蛋白质的正交试验设计

在单因素试验得到的最适氢氧化钠浓度、碱浸时间、碱浸温度、固液比的基础上，选择氢氧化钠浓度、碱浸时间、碱浸温度、固液比4个因素为考察对象，设计四因素三水平正交试验对工艺条件进行优化。正交试验设计见表2。

表2　脱除蛋白质的正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of deproteinization orthogonal experiment

1.5甲壳素样品定性和定量分析

甲壳素定性检测采用红外光谱对比法：分别将标准甲壳素和所制备的甲壳素烘干，2 mg待测样品与100 mg KBr混合，通过压片法制成薄片，用红外光谱仪扫描范围400 cm-1～4 000 cm-1［17］，通过对比两者的红外光谱图，确定本研究制备的样品是否为甲壳素。

甲壳素得率计算方法：甲壳素含量/%=（所提甲壳素重量干重W1/所用该种昆虫干重W2）×100［6，18］。

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1柠檬酸酸浸浓度试验结果的分析

柠檬酸酸浸浓度试验结果见图1。

图1　柠檬酸浓度对脱除无机盐的影响Fig.1 Effect of citric acid concentration on demineralization

由图1可知，随着柠檬酸浓度的增加，灰分含量逐渐下降，脱除无机盐的效果较明显；当柠檬酸浓度达到1.8 g/L以后其灰分含量总体虽也在下降，但下降趋势不明显，当浓度由1.8 g/L变为2.2 g/L时，灰分含量减少量不大，且随着柠檬酸浓度的增加甲壳素容易水解。同时也考虑在实际操作中，柠檬酸浓度过高会使反应速率过快而不容易控制，因此，选择柠檬酸浓度为1.8 g/L较为合适。

2.1.2柠檬酸酸浸时间试验结果的分析

柠檬酸酸浸时间试验结果见图2。

图2　反应时间对除去无机盐的影响Fig.2 Effect of reaction time on demineralization

在反应的初始阶段，随着酸浸时间的延长，灰分含量下降较为明显，脱除无机盐效果较明显；当反应时间达到30 h以后其灰分含量总体虽也在下降，但下降趋势明显减缓。由于甲壳中碳酸钙是与甲壳素和蛋白质结合在一起的，在柠檬酸与碳酸钙的反应中，部分碳酸钙被甲壳素紧密的胶状分子团结构所包围，柠檬酸很难完全渗透到里面，导致其不能彻底与其反应完全。当达到30 h以后，柠檬酸和碳酸钙的反应基本达到了平衡，再延长时间对脱除无机盐效果的影响不大。因此，选择酸浸时间为30 h即可。

2.1.3柠檬酸酸浸固液比试验结果分析

柠檬酸酸浸固液比试验结果见图3。

当固液比由1∶7（g/mL）变至1∶9（g/mL）时，灰分含量下降趋势较为明显，而当固液比由1∶9（g/mL）变至1∶11（g/mL）时灰分含量有所减少，但很缓慢。故以固液比1∶9（g/mL）浸泡脱除无机盐为宜。

2.1.4氢氧化钠碱浸浓度试验结果分析

氢氧化钠碱浸浓度试验结果见图4。

图3　固液比对除去无机盐的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on demineralization

图4　氢氧化钠浓度对除去蛋白质的影响Fig.4 Effect of NaOH concentration on deproteinization

结果表明，氢氧化钠的质量分数浓度越高，脱除蛋白质的效果越好，当氢氧化钠质量分数＞6%时，对脱除蛋白质的影响效果不是很大，而且随着氢氧化钠浓度的增加容易使甲壳素脱乙酰化生成壳聚糖，综合考虑各种因素以质量分数为6%的氢氧化钠溶液浸泡为宜。

2.1.5氢氧化钠碱浸时间试验结果分析

氢氧化钠碱浸时间试验结果见图5。

图5　碱浸时间对除去蛋白质的影响Fig.5 Effect of NaOH reaction time on deproteinization

从图5可以看出，在反应的初始阶段，随着碱煮时间的延长，残余蛋白质的含量急剧下降，脱除蛋白效果明显；在5 h以后其蛋白质含量总体虽在下降，但下降的趋势减缓。一般来说，脱蛋白时间越长，蛋白质水解的越彻底，但水解速度逐渐减慢；当延长到某一时刻以后，蛋白质的水解反应进行得非常缓慢，其对脱除蛋白效果的影响便不再明显。同时也考虑到长时间高温反应会带来生产成本上的增加，因此，选择碱煮时间为5 h较为合适。

2.1.6氢氧化钠碱浸温度试验结果的分析

氢氧化钠碱浸温度试验结果见图6。

图6　碱浸温度对除去蛋白质反应的影Fig.6 Effect of NaOH reaction temperature on deproteinization

结果表明，随着碱煮温度的升高，残余蛋白质含量急剧下降，脱蛋白效果明显；当达到85℃以后，残余蛋白质含量下降的趋势减缓。温度对氢氧化钠水解蛋白质有很大的影响，在其它条件固定的情况下，反应温度越高，蛋白质碱水解的速度越快；但温度达到一定值时，蛋白质碱水解速度逐渐变慢，蛋白质的碱水解反应慢慢趋于平衡，继续升温对脱蛋白效果影响不大。同时也考虑到高温反应会增加生产成本，因此，碱煮温度取85℃比较合适。

2.1.7氢氧化钠碱浸固液比试验结果的分析

氢氧化钠碱浸固液比试验结果见图7。

图7　碱浸固液比对除蛋白质反应的影响Fig.7 Effect of NaOH solid-liquid ratio on deproteinization

结果表明，固液比越大，脱除蛋白质的效果也越好，固液比大于1∶12（g/mL）时，对除蛋白的影响效果不是很大，因此以1∶12（g/mL）的固液比浸泡为宜。

2.2正交试验

2.2.1脱除无机盐的正交试验结果

脱除无机盐的正交试验结果分析见表3。

结果表明，以柠檬酸处理过的样品中的灰分含量为指标，筛选出脱除无机盐的最佳条件，灰分含量越低，说明无机盐脱除的越彻底，从表3可得最佳条件为A1B1C2，即柠檬酸浓度1.6 g/L、固液比1∶9（g/mL）、在室温条件下反应28 h即可；由正交试验灰分含量的极差结果可以看出，C＞B＞A，即在室温条件下，固液比＞柠檬酸浓度＞反应时间，固液比的极差最大，柠檬酸浓度次之，这两个因素是影响脱除无机盐的关键性因素，而反应时间的极差最小，说明它对脱除无机盐的影响较小。

表3　脱除无机盐的正交试验设计及结果Table 3 Orthogonal test results of demineralization

按最佳条件进行验证试验，测得残余灰分为1.54%，说明该条件脱除无机盐最彻底。

2.2.2脱除蛋白质的正交试验结果

脱除蛋白质的正交试验结果见表4。

表4　脱除蛋白质的正交试验设计及结果Table 4 Orthogonal test results of deproteinization

续表4　脱除蛋白质的正交试验设计及结果Continue table 4 Orthogonal test results of deproteinization

结果表明，以氢氧化钠处理过的样品中蛋白质含量为指标，筛选出脱除蛋白质的最佳试验条件，剩余蛋白质含量越低，说明蛋白质脱除的越彻底，从表4正交试验结果可得最佳条件为A3B2C3D3，即氢氧化钠浓度7%、固液比1∶13（g/mL）、在87℃下反应5 h即可；由正交试验剩余蛋白质含量的极差结果可以得出，D＞B＞C＞A，即氢氧化钠溶液浓度对蛋白质脱除影响最大，反应时间次之，固液比再次之，温度对蛋白质脱除影响最小。

按照最佳条件进行验证试验，测得残余蛋白质含量为0.015 μg/mL，说明该条件脱除蛋白质最彻底。

2.3定性和定量分析

2.3.1定性分析

甲壳素的红外吸收光谱分析：对在最佳条件下制备的甲壳素产品进行质量分析与结构表征。甲壳素产品红外光谱如图8所示。

图8　两种甲壳素样品的红外光谱Fig.8 IR spectrum of two samples

红外光谱图中3 400cm-1是O-H伸缩振动吸收峰；3 270 cm-1是N-H伸缩振动吸收峰；2 960 cm-1～2 879 cm-13个吸收峰是C-H伸缩振动吸收峰；分别在1 657、1 557、1 315 cm-1的吸收峰，分别是酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ谱带，这3个吸收峰是甲壳素的特征吸收峰；1 030 cm-1～1 157 cm-1之间的4个吸收峰，是C-O伸缩振动吸收峰；897 cm-1是环伸缩振动吸收峰［11］。由图8可见，通过比对在最佳条件下制备的甲壳素样品与标准甲壳素样品红外光谱图可知，本工艺制备的尖尾东鳖甲甲壳素样品与标准甲壳素样品化学结构一致。

2.3.2定量分析

在最佳试验条件下，得到的甲壳素样品的得率为21.45%。

3　结论

1）本试验以尖尾东鳖甲为试验材料，先通过单因素试验得到各因素的最佳试验条件，然后根据单因素试验得到的结果再进行正交试验，从而对单因素试验得到的各因素的最佳试验条件进一步优化，最终得到提取甲壳素的最佳条件。

2）通过紫外吸收法测定提取物中的残余蛋白质含量，根据国标测定提取物中残余灰分含量。初步确定了甲壳素提取的最佳工艺条件：柠檬酸浓度1.6 g/L，浸泡固液比1∶9（g/mL），浸泡时间28 h；脱除蛋白质的条件：氢氧化钠溶液浓度7%，浸泡温度87℃，固液比1∶13（g/mL），浸泡时间5h。在此工艺条件下制备的甲壳素产品为白色蓬松状固体，甲壳素得率21.45%。

3）本研究首次以尖尾东鳖甲成虫为试验材料制备甲壳素，结果显示，该虫甲壳素得率达20%以上，高于虾蟹壳的得率，产品颜色呈白色片状固体；对其产品进行红外光谱分析并比对标准图谱，证实了本试验所提取的甲壳素样品与标准甲壳素样品化学结构一致，确为甲壳素。昆虫作为甲壳素含量丰富的资源，其自身优势十分明显。目前由单位昆虫获得的甲壳素产量、质量和提取流程上，具有比虾蟹壳单位产量高、提取流程简单、产品质量高、蛋白含量相对较少等明显优势，具有广泛利用的前景，能够用于解决多种人类“文明病”。目前对昆虫类甲壳素涉及其免疫调节和抑制真菌的功效仅有少量报道。对于昆虫类甲壳素制备方面的研究开展相对比较滞后，研究也局限在个别昆虫种类。对甲壳素制备方面和利用的研究的欠缺明显制约了昆虫类甲壳素的广泛应用。昆虫丰富的物种资源以及其巨大的天然合成能力没有得到相应的利用，相信随着对大量不同种类昆虫的深入研究，必定能够利用好这一丰富的天然资源。

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Study on the Extracting Chitin from Anatolica mucronata Reitter

ZHANG Jian-ying1，JIA Long2，ZHANG Da-zhi1，XI Qiao-hong1
（1. College of Life Science，Ningxia University，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2. College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

Abstract：This article discussed the optimum conditions of extracting chitin from Anatolica mucronata Reitter by single-factor and orthogonal test. The chitin sample was carried on the qualitative and quantitative analysis. Test results showed that the optimum conditions by using acid-alkali method to extract chitin were as follows：the NaOH concentration 7%，the temperature 87℃，the time 5 h，the solid- liquid ratio 1∶13（g/mL），the citric acid concentration 1.6 g/L，the time 28 h，the solid- liquid ratio 1∶9（g/mL），at room temperature. Using infrared spectrum to analysis chitin sample extracted under optimum conditions and the extraction rate of chitin was 21.45%. Then residual protein and inorganic salt content in the extract were measured by UV absorption and dry ashing method．

Key words：chitin；Anatolica mucronata Reitter；oputimum conditions；extraction；insect resource

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.015

基金项目：2015年度宁夏自然科学基金资助项目（NZ15052）

作者简介：张建英（1978—），女（汉），副教授，硕士，从事动物资源开发与利用研究。

收稿日期：2015-03-23