周艳萍，赵晓宁，段金婷，王焕香，商华，罗飞，朱光华，傅晓方，高大威*（. 燕山大学环境与化学工程学院，河北秦皇岛　066004；. 中国长城葡萄酿酒有限公司，河北怀来　075499）



葡萄酒发酵过程中常见风味物质含量变化的研究

周艳萍1，赵晓宁2，段金婷1，王焕香2，商华2，罗飞2，朱光华2，傅晓方2，高大威1*
（1. 燕山大学环境与化学工程学院，河北秦皇岛066004；2. 中国长城葡萄酿酒有限公司，河北怀来075499）

摘要：葡萄酒由于其营养价值以及对健康的有益效果越来越受到人们的关注。葡萄酒风味物质是葡萄酒质量的重要决定因素，也是葡萄酒香气特征的物质基础。本研究分别利用滴定法、高效液相色谱法等，对葡萄酒不同发酵时期的几种风味物质包括单宁、苹果酸、乳酸和白藜芦醇等化学成分的含量进行测定，并分析其在葡萄酒发酵过程中含量的变化规律，从而为人工影响葡萄酒的品质提供科学的数据。

关键词：葡萄酒；风味物质；单宁；苹果酸；乳酸；白藜芦醇

随着人们生活品质的提高，葡萄酒越来越受到大众的追捧。鉴赏葡萄酒，一般需观其色、闻其香、品其味，好的葡萄酒色泽清澈自然，香气纯正优雅，饮用后令人神清气爽。葡萄酒是一种美好的风味食品，这种风味是葡萄酒中的成分和饮酒人的感觉相互作用产生的。研究人员已从葡萄酒中鉴别出1000多种风味化合物，这些化合物除源于葡萄果实外，绝大部分是在发酵过程中产生的，它涵盖了不同类别的有机化合物，如烃类、醇类、萜烯醇类、酯类、醛类、酮类、酸类、含硫化合物等。风味物质在葡萄酒中的含量及其组成决定着葡萄酒的特性，因此，研究葡萄酒中的风味物质对于改善和提升葡萄酒的风味，使其更适应我国人民大众的口味，是葡萄酒生产和销售中不容忽视的重要环节。

目前，关于葡萄酒风味物质成分的检测已见报道［1-3］，而有关风味物质在发酵过程中含量变化的研究还比较少。本文分别采用滴定法和高效液相色谱法检测影响葡萄酒风味的物质，包括单宁、苹果酸、乳酸和白藜芦醇，并分析发酵过程中物质的变化，得出最佳发酵条件，为人工影响葡萄酒品质提供科学数据。

1　材料与方法

1.1葡萄酒样品来源

本研究所采用的葡萄酒样品为赤霞珠葡萄酒，均来自中国长城葡萄酒有限公司沙城产区，在葡萄酒酿造期间每隔一天采样一次，直至发酵结束。

1.2主要试剂和仪器

磷酸、靛红、浓硫酸购于天津市风船化学试剂科技有限公司；柠檬酸标准品、乙腈、甲醇（色谱纯）购于中国药品生物制品检定所；苯酚、高锰酸钾购于天津市天新精细化工开发中心；磷酸二氢钾购于天津泰兴试剂厂；Agilent 1100 Series型高效液相色谱仪购自美国安捷伦公司。

1.3单宁的测定

采用高锰酸钾滴定法来测定单宁含量［4-6］。样品加水后可以浸提出单宁，因单宁为强还原剂，极易被氧化，采用高锰酸钾进行滴定，以靛红为指示剂。靛红被KMnO4氧化后，由蓝色最终变为亮黄色，从而可以指示滴定终点。计算公式如下：

式中：

M表示KMnO4标准溶液的摩尔浓度（moL/L）；

V1表示葡萄酒样滴定消耗的KMnO4溶液的量（mL）；

V2表示空白样滴定消耗的KMnO4溶液的量（mL）；

B表示样品提取液定容总体积（mL）；

b表示测定时取样液的体积（mL）；

W表示样品的重量（g）；

0.0416表示1 mmol KMnO4溶液氧化的单宁克数。

1.4苹果酸、乳酸的测定

采用高效液相色谱法来测定苹果酸、乳酸含量［7-8］。

标准使用液配制：用双蒸水将苹果酸、乳酸混合酸的标准储备液稀释成浓度为0.025 g/L、0.05 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L的标准溶液，备用。

色谱柱：ZORBAX XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：214 nm；流动相：5%甲醇和95%用双蒸水配的0.1%的磷酸；流速：0.8 mL/min；柱温：室温；压力：93 bar；进样量：20 μL。

将不同浓度的苹果酸、乳酸混合酸的标准液分别进样，进行定量测定。根据苹果酸、乳酸标准品的浓度和峰面积的关系绘制标准曲线。

1.5白藜芦醇的测定

白藜芦醇含量的测定方法为高效液相色谱法（HPLC）［9-11］。

配置9个不同浓度的白藜芦醇标准液，其浓度分别为0.1 g/L、0.05 g/L、0.025 g/L、0.0125 g/L、0.00625 g/L、0.003125 g/L、0.0015626 g/L、0.00078125 g/L、0.00039062 g/L。将9个不同浓度的白藜芦醇标准液分别装到100 mL的磨口三角瓶中，放到冰箱中备用。

色谱柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：306 nm；流动相：32%乙腈和68%双蒸水；流速：1 mL/min；柱温：室温；压力：200 bar；进样量：20 μL。

将不同浓度的白藜芦醇标准系列溶液进液相色谱仪测试，绘制峰面积与标准溶液的浓度标准曲线，根据标准曲线计算白藜芦醇的含量。

图1　在发酵周期中葡萄酒样中单宁含量的变化

2　结果与分析

2.1各个发酵时期酒样单宁含量的变化趋势分析

由实验方法可知，其中M=0.01 mol/L，B=10 mL，b=2.5 mL，通过测定及公式计算出的单宁各时期的百分含量，绘制变化趋势图。由图1可以看出，单宁含量首先呈降低趋势，由于单宁主要存在于葡萄的果梗、果皮中，推测开始时混入了一定量的葡萄枝梗，单宁直接融入酒液中，随着葡萄梗被筛出去，单宁含量稍有降低。随着发酵的进行，一部分来源于葡萄的单宁（内源单宁），在葡萄酒发酵的过程中从葡萄果皮和籽中浸提出来，所以在发酵第9天，呈上升趋势。之后内源单宁虽在发酵过程中继续浸提出来，但同时单宁也与其他物质反应而被消耗，如单宁与水溶性蛋白和非水溶性蛋白的反应、与金属离子的络合作用，以及在酶、水、空气、碱性等条件下的氧化。单宁的消耗速度大于从葡萄中浸渍速度，便呈现了逐渐下降趋势。除酿酒工艺的影响外，带皮发酵能够促使更多的单宁进入葡萄酒中，与此同时，单宁与酒液中其他物质的相互反应没有之前那么激烈，速度相对减缓，当单宁消耗速度小于其浸出速度时，单宁的百分含量第二次升高，直到逐渐稳定达到平台期。

2.2苹果酸、乳酸测定结果及其分析

将苹果酸、乳酸标准液分别进样，得到苹果酸、乳酸的保留时间分别为4.0 min、4.8 min左右（图2）。分别以其浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制苹果酸、乳酸标准曲线。用Origin7.0软件进行线性回归，得到线性回归方程分别为：y=2.74126+638.80178x（R2=0.9997）；y=0.13835+644.89463x（R2=0.9998）。

从图3可见，葡萄酒在发酵过程中苹果酸的含量呈下降趋势，而乳酸呈上升趋势。葡萄酒中的苹果酸来源于葡萄，前段的下降主要是由于在酒精发酵的过程中被酵解。从发酵第11天至发酵第25天这一段平台期可能是由于酵母菌分解苹果酸已经达到阈值，苹果酸浓度不再下降。后一段时间苹果酸含量下降后达到平台期，主要是由于葡萄酒进入苹果酸-乳酸发酵后，乳酸菌分解苹果酸而产生乳酸而导致的。综上：苹果酸在发酵过程中含量的降低一部分是由于酵解，另一部分是由于乳酸菌的分解而减少；葡萄酒中的乳酸并不是来源于葡萄，而是发酵的产物；葡萄酒在发酵过程中乳酸含量变化趋势线中前段的上升主要是由于前发酵的过程中酵母代谢产生少量的乳酸，后一段时间乳酸含量上升主要是由于进入苹果酸-乳酸发酵后，乳酸菌分解苹果酸而产生乳酸导致的。

由图3可知，苹果酸乳酸总量并不完全符合化学计量关系，也有一定的变化趋势。前发酵过程中呈先缓慢下降后上升的趋势，直到第17天与开始含量相差不多，在后发酵过程中，又一次呈先下降后上升的趋势直到平稳。总的来说，苹果酸乳酸总量减少主要是苹果酸通过酶的作用或其它代谢途径产生乳酸以外的其他物质。苹果酸乳酸总量的增加主要是由于发酵过程中其它代谢途径或化学反应产生乳酸。通常，多数干型葡萄酒都含有一定浓度的残糖，主要有己糖（果糖和葡萄糖）及少量戊糖（木糖、核糖和阿拉伯糖），这些糖均能被苹果酸-乳酸菌所代谢，研究较多的是己糖的发酵，乳酸菌能够利用6-磷酸果糖途径和磷酸戊糖途径分解己糖，生成乳酸、酒精、乙酸及CO2等产物，乳酸含量增加，使苹果酸和乳酸总量增加［12］。

图2　苹果酸、乳酸标准品色谱图

图3　发酵过程中苹果酸、乳酸及总酸的变化趋势

2.3白藜芦醇测定结果及其分析

在上述的最佳色谱条件下得到白藜芦醇标准品的高效液相色谱图见图4，白藜芦醇的保留时间在4.7 min左右。以白藜芦醇标准液的浓度为横坐标，以白藜芦醇峰的峰面积为纵坐标，绘制白藜芦醇标准曲线，用Origin 7.0软件进行线性回归，得到线性回归方程y=101555x-4.3934（R2=0.9997），相关性较高。

由图5可知，从发酵开始，白藜芦醇含量逐渐缓慢上升，直至发酵第5天达到最大值。主要是由于葡萄酒中的白藜芦醇来源于葡萄，当葡萄除梗并且破碎成汁的时侯，白藜芦醇（苷）及其衍生物均存在于葡萄皮和葡萄籽中，其存在形式为与β-葡萄糖苷、花青素及单宁等结合生成的非黄酮类多酚化合物，并没有游离进入到葡萄汁中，所以发酵初期葡萄汁中白藜芦醇含量相对较少。由于果胶酶（葡聚糖酶）的添加和酵母发酵的进行，在酶解作用下使葡萄皮中的白藜芦醇（苷）以及其衍生物单体释放出来，之后被发酵所产生的酒精反复萃取进入葡萄酒中，因此，随着酒精量的增加，白藜芦醇的含量也有所增加。当葡萄皮、籽中的白藜芦醇完全萃取进入到葡萄酒中并形成单体时，白藜芦醇的来源被切断，所以葡萄酒中白藜芦醇在发酵第5天到第19天以其最大值时保持一定的时间。发酵19天后，酒精发酵完成，除去皮渣进入苹乳发酵，轻度氧化作用使白藜芦醇及其衍生物含量稍有下降并维持在一定水平。白藜芦醇在葡萄酒发酵过程中整体上存在流失现象，但是发酵过程也会产生微量的白藜芦醇。

图4　白藜芦醇标准品色谱图

图5　葡萄酒在发酵过程中白藜芦醇的变化趋势

3　结论

葡萄酒中的酸类、糖类、酚类等物质对葡萄酒风味起到重要作用。随着科技的发展，葡萄酒风味的分析手段越来越精确。本研究中分别采用滴定法和高效液相色谱法测定了干红葡萄酒中的单宁、苹果酸、乳酸和白藜芦醇在葡萄酒不同发酵时期的含量变化，单宁含量呈先增大后减小再增大的趋势，苹果酸总体呈下降趋势，乳酸总体呈上升趋势，总酸含量变化不大，白藜芦醇含量先增大后减小，然后保持平稳。根据各物质在各发酵时期的含量变化趋势，结合生产实际，可以把理化分析数据和感官特性结合起来，相辅相成，为改进和提高葡萄酒工艺，提高葡萄酒质量提供科学依据。

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并列第一作者：赵晓宁（1988-），女，硕士学位，从事葡萄酒酿造工作。E-mail： zhaoxiaoning2013@sina.com

Changes of the common flavour of grape wine in fermentation process

ZHOU Yanping1, ZHAO Xiaoning2, DUAN Jinting1, WANG Huanxiang2, SHANG Hua2, LUO Fei2, ZHU Guanghua2, FU Xiaofang2, GAO Dawei1*
（1. College of Environmental and Chemical Engineering, Yanshan University, Qin Huangdao, Hebei, 066004；2. China Greatwall Wine Co., Ltd, Huailai, Hebei, 075499）

Abstract：Grape wine has drawn more and more attention currently for its nutrition and healthy function. Grape Wine flavour is an important determinant of wine quality, and it is also the material basis of wine aroma characteristics. The contents of four kinds of chemical compositions （tannin, malic acid, lactic acid, resveratrol） in wine were determined during different fermentation periods by different test methods, and the trends were analyzed to obtain the variational rule during the brewing process, to provide scientific data for the quality of wine.

Key words：wine； flavor substance； tannin； malic acid； lactic acid； resveratrol

中图分类号：TS262.6

文献标识码：A

DOI：10.13414/j.cnki.zwpp.2016.03.005

收稿日期：2016-03-14

项目基金：秦皇岛市科学技术研究与发展计划（基金号：201402B029）

作者简介：周艳萍（1980-），女，硕士学位，主要从事生物化学和分析化学的研究工作。

*通讯作者：高大威（1970-），女，教授，主要从事微生物发酵和纳米生物学研究。E-mail： dwgao@ysu.edu.cn