李 状，张 玮，王 琪，阳志军，李 力广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科，广西 南宁 530021



沉默二氢叶酸还原酶基因对卵巢癌细胞体外生物学行为的影响

李 状，张 玮，王 琪，阳志军，李 力
广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科，广西 南宁 530021

［摘要］背景与目的：二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）在卵巢上皮癌铂类耐药细胞中高表达。该研究旨在探讨DHFR基因沉默对卵巢癌细胞体外生物学行为的影响，为卵巢癌铂类耐药的治疗奠定基础。方法：设计DHFR基因靶向的发夹状siRNA，筛选出最佳siRNA沉默片段，构建携带有目的基因的慢病毒载体细胞即转染组（DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞）及阴性对照组细胞（pGCSIL-SKOV3细胞）。采用流式细胞仪检测3组细胞在不同的顺铂质量浓度（2.5、5.0、10.0和20.0 μg/mL）下不同时间段（24、48及72 h）的凋亡情况以及IC50顺铂质量浓度（4.4 μg/mL）的周期变化；采用高效液相色谱法检测不同顺铂质量浓度（2.5、5.0和7.5 μg/mL）不同时间段（24和48 h）药物作用后3组细胞内的顺铂浓度。采用透射电镜观察IC50顺铂质量浓度（4.4 μg/mL）3种细胞的超微结构变化。结果：将退火后的双链寡核苷酸片段连接到pGCSIL/GFP载体，测序结果正确。转染SKOV3细胞后，蛋白［质］印迹法（Western blot）鉴定干扰效果。在给药24、48和72 h后，DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3三组细胞的凋亡率随着顺铂质量浓度（2.5、5.0、10.0和20.0 μg/mL）的上升而升高，DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞给药48和72 h后的凋亡率明显高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。3组细胞在IC50顺铂质量浓度（4.4 μg/mL）给药24和48 h后，转染组G0/G1期细胞比例较阴性及空白对照组明显增多，G2/M、S期则反之；而给药72 h后，3组细胞以G2/M及S期为主，转染组低于阴性及空白对照组。采用高效液相法检测细胞内顺铂质量浓度时，转染组在2.5和5.0 μg/mL顺铂质量浓度给药24和48 h后，其细胞内顺铂浓度均明显高于对照组。……