孙红生(胜利石油管理局河口医院，山东东营257200)



硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响及机制

孙红生(胜利石油管理局河口医院，山东东营257200)

摘要：目的观察硼替佐米对多发性骨髓瘤(MM)细胞凋亡的影响，探讨其作用机制。方法将体外培养的MM细胞株RPMI8226随机分组，分别加入20、40、80和160 nmol/L硼替佐米(硼替佐米组)，对照组未加药物，处理24 h时收集各组细胞。采用Anexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况，计算凋亡指数；采用Real-time PCR和Western blotting法分别检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA和蛋白表达。结果20、40、80、160 nmol/L硼替佐米作用24 h时细胞凋亡指数分别为0.21±0.03、0.21±0.02、0.23±0.03、0.26±0.02，对照组分别为0.01±0.00，组间比较及各浓度间比较P均<0.05。硼替佐米组β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达均低于对照组(P均<0.01)；随硼替佐米浓度升高，β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达逐渐降低(P均<0.01)。结论硼替佐米可诱导MM细胞凋亡，抑制Wnt/β-catenin信号通路可能是其作用机制之一。

关键词：多发性骨髓瘤；硼替佐米；Wnt/β-catenin信号通路；凋亡

多发性骨髓瘤(MM)是一类浆细胞异常恶性进展性疾病[1]。目前治疗MM最好的方法是异基因造血干细胞移植联合反应停及其衍生物化疗，但完全缓解率不足10%，中位生存期仅3～4年，进展期患者的中位生存期仅6个月[2]。硼替佐米是一种新型的蛋白酶抑制剂，是人工合成的丙氨酸基硼酸衍生物。临床前研究证实，硼替佐米可以通过诱导多种血液肿瘤和实体肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用，但其抗肿瘤作用的确切机制仍不明确[3,4]。2012年1月～2014年12月，本研究观察了硼替佐米对MM细胞凋亡的影响，探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1材料MM细胞株RPMI8226购自美国模式菌种收集中心(ATCC)。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1和β-actin抗体均购自Santa Cruz公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自日本同仁化学研究所，Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)均购自宝生物工程(大连)有限公司。ECL发光试剂盒购自美国Pierce公司。

1.2细胞培养及分组处理MM细胞株RPMI8226悬浮培养于含有90% RPMI1640、10%灭活FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 U/mL硫酸链霉素的培养基，置于5% CO2培养箱中37 ℃培养，每48 h传代1次。取对数生长期细胞，随机分组，分别加入20、40、80和160 nmol/L硼替佐米(硼替佐米组)，对照组未加药物，每组设3个平行孔，处理24 h时收集各组细胞，用于后续研究。

1.3细胞凋亡处理24 h时收集各组细胞于1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤细胞。采用Anexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况，根据染色细胞数量除以总细胞数计算凋亡指数。

1.4β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA表达处理24 h时收集各组细胞于1.5 mL离心管中，加入1 mL TRIzol，提取总RNA。按照RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒进行逆转录。根据SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书配制25 μL Real-time PCR反应体系，于ABI 7500荧光定量PCR仪进行PCR扩增，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算β-catenin、Survivin、c-myc和Cyclin D1 mRNA的相对表达量。

根据NCBI Genbank上已公布的人β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1和β-actin基因的mRNA序列合成PCR引物[5]，所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。

1.5β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1蛋白表达处理24 h时收集各组细胞于1.5 mL离心管中，用含0.1% PMSF的预冷PBS洗涤2次，加入400 μL细胞裂解液于冰上静置30 min，4 ℃下10 000 r/min离心30 min，取上清液，采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。取100 μg蛋白加入4×SDS-PAGE Loading buffer沸水中孵育10 min，然后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后切下目的蛋白凝胶于转膜仪上转移至PVDF膜，加入鼠抗人β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1和β-actin抗体孵育过夜， 利用ECL发光试剂盒显影， 采用化学发光成像系统观察、拍照，以对照组表达量为1，计算硼替佐米组各蛋白的相对表达量。

表1　各基因的引物序列

2结果

2.1细胞凋亡指数20、40、80、160 nmol/L硼替佐米作用24 h细胞凋亡指数分别为0.21±0.03、0.21±0.02、0.23±0.03、0.26±0.02，对照组为0.01±0.00，组间比较及各浓度间比较P均<0.05。

2.2β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA表达硼替佐米组β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA表达均低于对照组(P均<0.01)；随硼替佐米浓度增加，β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA表达逐渐降低(P均<0.01)，且均低于对照组(P均<0.01)。见表2。

表2　　　　各组β-catenin、Survivin、c-myc、

注：组间及各浓度间比较，P均<0.01。

2.3β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1蛋白表达硼替佐米组β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1蛋白表达均低于对照组(P均<0.01)；随硼替佐米浓度增加，β-catenin、Survivin、c-myc和Cyclin D1蛋白表达逐渐降低(P均<0.01)，且均低于对照组(P均<0.01)。见表3。

表3　　　　各组β-catenin、Survivin、c-myc、

注：组间及各浓度间比较，P均<0.01。

3讨论

硼替佐米是一种双肽基硼酸盐类似物，是在蛋白质降解的“泛素-蛋白酶体”通路理论基础上研发的新型抗肿瘤药物。硼替佐米作为全世界第一种人工合成的用于临床的蛋白酶体竞争性抑制剂，可通过多种途径发挥抗MM作用[6，7]。研究显示，硼替佐米可促进MM细胞内促凋亡蛋白NOXA和抑癌基因p53表达，从而诱导细胞凋亡[8]。硼替佐米通过Caspase-8依赖性Sp1蛋白质激活Caspase通路，导致组蛋白去乙酰化酶基因家族Ⅰ表达下调，使组蛋白高度乙酰化，从而诱导骨髓瘤细胞凋亡[9]。目前，硼替佐米促凋亡作用与Wnt/β-catenin信号通路关系的报道较少。

Wnt/β-catenin信号通路是生物体内一条重要的且极为保守的信号通路，参与细胞生长和胚胎发育，与细胞增殖、凋亡密切相关，在肿瘤发生发展过程中发挥关键性作用。在许多人类肿瘤组织和细胞中β-catenin呈异常表达，如在Wnt-1缺陷鼠肿瘤模型中可见乳腺原发癌和肺转移灶消失；在鼻咽癌和食管鳞癌中，由于甲基化作用Wnt抑制因子1活性失活，Wnt通路异常激活，促进肿瘤形成[10]；高迁移率组1(HMGA-1)是Wnt/β-catenin信号通路的下游基因。敲除HMGA-1基因显著降低小鼠胃癌细胞增殖[11]；在胃和结肠良性肿瘤恶变形成的早期阶段，Wnt-1抑制因子Sox17表达下调，导致Wnt活性增强，促进胃和结肠恶性肿瘤进展[12]；Wnt-1过表达与乙型与丙型肝炎相关性肝癌、非小细胞肺癌以及黑色素瘤与唾液腺癌的发生发展及预后密切相关[13]。Wnt/β-catenin信号具有多种下游靶基因，包括调控细胞凋亡和坏死的基因，如β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1，一旦启动这些基因，细胞将启动凋亡或坏死程序。虽然目前对于Wnt/β-catenin信号通路对细胞凋亡和坏死的调控机制已有许多研究，但这些研究尚处于起步阶段，还有许多未知机理等待发掘[14]。由于Wnt/β-catenin信号通路及其下游靶基因的异常变化与肿瘤的发生发展密切相关，因此抑制Wnt/β-catenin信号通路被认为是理想的肿瘤治疗策略[15]。

本研究中，20、40、80、160 nmol/L硼替佐米处理24 h，RPMI8226细胞凋亡指数逐渐增加，Wnt/β-catenin信号通路标志蛋白β-catenin、Survivin、c-myc和Cyclin D1 mRNA和蛋白表达均逐渐降低，且具有剂量依赖性；提示抑制Wnt/β-catenin信号通路可能是硼替佐米诱导MM细胞凋亡的机制之一，但其确切作用机制还需进一步探讨。

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(收稿日期：2016-01-28)

中图分类号：R733.3

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)12-0033-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.010