孙晓叶，康永振，沈中阳(天津市第一中心医院 天津市器官移植重点实验室，天津3009；天津市宝坻区人民医院)



肝移植患者术后14天内胆汁中胆汁酸水平变化及其对缺血性胆管损伤发生的预测价值

孙晓叶1，康永振2，沈中阳1(1天津市第一中心医院 天津市器官移植重点实验室，天津300192；2天津市宝坻区人民医院)

摘要：目的观察肝移植患者术后14天内胆汁中胆汁酸水平变化，探讨其对缺血性胆管损伤(ITBL)发生的预测价值。方法选取原位肝移植手术患者39例，采用液相色谱串联质谱法检测术后第1、3、7、14天胆汁中6种胆汁酸水平变化，即甘氨胆酸(GCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨酸结合脱氧胆酸(GDCA)、牛磺酸结合脱氧胆酸(TDCA)。术后随访3个月，以胆道造影结果为金标准判定是否发生ITBL，比较发生ITBL者(ITBL组)与未发生者(N-ITBL组)术后第1、3、7、14天各胆汁酸水平，采用ROC曲线评价各胆汁酸对术后发生ITBL的预测价值。结果术后第1天，ITBL组胆汁中GDCA水平较N-ITBL组降低；术后第7天，ITBL组胆汁中GCA、GDCA水平较N-ITBL组升高；术后第14天，ITBL组胆汁中TLCA、GCDCA、GDCA水平较N-ITBL组升高；组间比较P均<0.05。ROC曲线分析显示，术后第14天胆汁中GCDCA水平对判断肝移植术后发生ITBL的AUC为0.751、TLCA的AUC为0.764，术后第7天GCA水平对判断肝移植术后发生ITBL的AUC为0.717。结论肝移植术后14天内胆汁中GCDCA、GCA、TLCA水平升高，三者对肝移植患者术后3个月内发生ITBL具有预测价值。

关键词：肝脏移植；胆汁酸；缺血性胆管损伤

肝移植是目前治疗各种终末期肝病的重要手段，但术后易发生胆道并发症，影响肝脏移植受者生存率和生活质量。缺血性胆管损伤(ITBL)是肝移植术后胆道并发症的常见类型，主要指肝移植术后非吻合口部位胆管树损伤，胆道造影显示供体侧肝内胆道扩张、狭窄，胆泥、胆石形成，甚至胆道损毁，是胆道并发症中最难处理的类型。胆汁酸的代谢异常与多种肝胆疾病密切相关，其质和量的变化对肝胆疾病的诊断、鉴别诊断及发病机理研究具有重要价值。本研究探讨肝移植患者术后14天内胆汁中胆汁酸水平变化对术后发生ITBL的预测价值。

1资料与方法

1.1临床资料选取2014年3月～2015年1月天津市第一中心医院接受原位肝移植手术患者39例，男35例、女4例，年龄31～69(49.5±9.3)岁，终末期肝病模型评分(MELD评分)6～41(16.3±8.7)分，Child-Pugh分级A级7例、B级17例、C级15例，原发病为单纯乙肝后肝硬化12例、乙肝肝硬化并发原发性肝癌6例、单纯原发性肝癌5例、酒精性肝硬化4例、单纯乙肝+丙肝后肝硬化2例、伴发原发性肝癌1例、隐源性肝硬化2例、丙肝后肝硬化2例、暴发性肝脏衰竭1例、肝血管肉瘤1例、家族性淀粉样变1例、慢加急肝脏衰竭1例、药物性肝损害1例。纳入标准： ①年龄≥16岁；②首次接受肝移植手术；③术前原发病为非胆道疾病，排除原发性硬化性胆管炎等；④术前无胆道感染、胆道手术及胆系结石等胆道相关并发症；⑤无不可控制的全身感染，术中留置T管；⑥术后存活3个月以上。

1.2胆汁酸检测研究对象均于术后第1、3、7、14天常规留取胆汁5～10 mL，编号并于-80 ℃深低温保存，3个月内分批采用液相色谱串联质谱法测定胆汁中6种胆汁酸水平，即甘氨胆酸(GCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨酸结合脱氧胆酸(GDCA)、牛磺酸结合脱氧胆酸(TDCA)。上述检测均由天津医科大学新科技应用研究所中心实验室完成。

1.3ITBL判定及其与胆汁酸水平的关系研究对象均进行为期3个月的随访观察，去除失访或死亡病例，以胆道造影结果为金标准判定是否发生ITBL。胆道造影具有如下改变判定为ITBL：①供体侧肝内外胆管局灶或弥漫性狭窄或扩张；②肝内3级以上末梢胆管充盈不良或显影浅淡；③肝内胆管不规则，如形态僵硬、管壁欠规整；④供体侧肝内外胆管局灶或弥漫性充盈缺损影。比较发生ITBL者与未发生者术后第1、3、7、14天6种胆汁酸水平变化。

2结果

2.1肝移植术后ITBL发生情况39例肝移植手术患者均获为期3个月的随访，期间共发生ITBL 11例(ITBL组)，均为男性，年龄31～60(50.5±10.1)岁，MELD评分7～20(11.9±4.5)分，Child-Pugh分级A级3例、B级5例、C级3例，原发疾病为乙肝后肝硬化4例、原发性肝癌2例、单纯乙肝+丙肝后肝硬化2例、酒精性肝硬化1例、丙肝后肝硬化1例、隐源性肝硬化1例，均无肝动脉血管相关并发症，1例存在门静脉主干及肠系膜上静脉狭窄合并肠系膜下动脉远端多发动静脉瘘。移植肝内外胆管狭窄伴扩张5例，包括左肝管狭窄2例、右肝管近端狭窄1例、左右肝管开口部同时狭窄1例、供体侧胆总管闭塞伴肝内胆管明显扩张1例；肝内胆管单发或多发充盈缺损影即胆泥形成3例，其中左肝管主干单发2例、右后肝管和左肝管起始部多发1例。胆道造影表现分支稀疏2例，移植肝肝内胆管广泛分支稀疏1例，左、右肝管开口部显影浅淡伴远端分支稀疏1例；造影表现为移植肝肝内胆管形态僵硬1例，左肝管主干纤细、右肝管分支稀疏。未发生ITBL 28例(N-ITBL组)，男24例、女5例，年龄31～69(49.5～10.1)岁。

2.2ITBL组、N-ITBL组肝移植术后胆汁中胆汁酸水平比较术后第1天，ITBL组胆汁中GDCA水平较N-ITBL组升高；术后第7天，ITBL组胆汁中GCA水平、GDCA水平较N-ITBL组升高；术后第14天，ITBL组胆汁中TLCA、GCDCA、GDCA水平较N-ITBL组升高；组间比较P均<0.05。见表1。

2.3胆汁酸对诊断ITBL的价值选取表1组间比较具有统计学意义的数据，ROC曲线分析胆汁酸对ITBL发生的预测价值，结果显示术后第14天TLCA水平对判断肝移植术后发生ITBL的AUC及敏感性最高，术后第7天GCA水平对判断肝移植术后发生ITBL的诊断特异性最高。

3讨论

肝移植术后胆道并发症发生率为10%～30%，其表现多样，ITBL是其中最常见和最难处理的类型，对移植受者的危害也最为严重[1,2]。肝移植术后ITBL病变广泛、病情反复，治疗时间长，再次肝移植是其治疗的主要方法。本研究肝移植术后ITBL发生率为28.2%， 高于以往报道[1,2]， 原因可能为我们放宽了ITBL的诊断标准，将胆道造影显示胆道形态不规则、管壁僵硬和胆道充盈不良、分支稀疏的病例均纳入到ITBL。肝移植术后早期胆道造影结果显示，胆道形态不规则和胆道充盈不良对发生ITBL的诊断敏感度和特异度可分别高达72.22%和87.44%[3]，因此如将这部分患者排除在外将使研究的假阴性率提高。肝移植术后非吻合口部位胆泥形成可能是ITBL的继发改变，常在胆管已有损害的基础上发生，特别是局灶性部位胆泥进行网篮清理后常可发现胆泥形成部位伴有狭窄形成，故本研究也未将其排除在外。考虑到部分患者在胆道已有病变时可能尚未出现肝脏酶学指标或血清总胆红素水平的升高，且肝脏酶学指标或胆红素水平的升高受其他非胆道因素的影响较大，因此本研究对ITBL的诊断主要依靠胆道造影结果。

表1　ITBL组、N-ITBL组肝移植术后第1、3、7、14天胆汁中胆汁酸水平比较

注：与N-ITBL组同时间点比较，*P<0.05；与同组第1天比较，#P<0.05。

表2　　　　胆汁酸对肝移植术后发生ITBL预测价值的

注：临界值为0.700。

肝移植术后发生ITBL是多因素共同作用的结果，其相关危险因素包括肝动脉血管并发症、胆管周围血管丛损伤[4]、灌注保存液的黏度大[5]、缺血-再灌注损伤、胆道二次热缺血损伤、ABO血型不相容[6]、排斥反应[7]、巨细胞病毒(CMV)感染和胆汁酸盐毒性等，涉及从供肝切取后的灌注、保存、修整到供肝植入时肝动脉吻合再到术后抗排斥和CMV感染的整个肝脏移植过程。非吻合口胆管狭窄最初被认为与肝动脉阻塞引起缺血有关，经典多型的胆道造影影像学特征有胆管狭窄、胆管扩张甚至胆管铸型形成；而后此类病变被认定为缺血性胆管炎或ITBL，说明肝动脉血管并发症的发生与ITBL关系密切。近年来越来越多的学者开始研究门静脉血液供应和氧供对ITBL发生的影响并取得进展[8]。Farid等[9]研究结果提示，门静脉血液供应在肝移植术后胆道系统血供和氧供方面具有重要的病理生理作用。本研究中11例发生ITBL患者未发现并存肝动脉血管性并发症，仅有1例并发门静脉主干和肠系膜上静脉狭窄合并肠系膜下动脉远端多发动静脉瘘，可能与本研究样本量少有关。

肝脏合成的胆盐占胆汁总固体量的50%～70%。胆盐既是胆固醇代谢的终产物，又是在细胞损伤及胆固醇、脂类、糖类代谢中活跃的信号分子。胆汁是有毒性的液体，但在生理状态下其对肝细胞和胆管上皮的毒性作用被顶端膜高胆固醇和鞘磷脂、胆盐微胶粒、胆汁水化或碱化等限制；此外，胆囊和较大胆管黏液形成的保护作用以及胆汁流动冲刷作用可降低胆汁与胆管上皮细胞膜顶端区域的作用时间，使胆汁的毒性作用难以显现[10]。但是，当胆汁在肝脏-胆道之间的输送中断或胆汁成分比例改变、胆盐/胆固醇失衡等均会导致胆汁毒性作用显现并继发肝细胞和(或)胆管损伤[11]。胆汁酸是双亲性分子，具有分子定向平衡和胶团形成两种特殊性能，这使得其在一定范围内(1～10 mmol/L)能够使生物膜的磷脂和蛋白质脱落，导致膜损害，引起细胞膜通透性增加并最终导致细胞死亡。胆汁酸对生物膜影响的突出表现为其对线粒体膜通透性的影响。线粒体在细胞内环境稳定方面发挥重要作用，但在胆汁淤积时其也最容易成为胆汁酸在细胞内攻击的靶点，成为细胞功能缺陷的始动因素。胆汁酸进入细胞后，抑制线粒体氧化呼吸化作用，使ATP合成减少，钙泵失活；同时，因为细胞膜对Ca2+的通透性增加，细胞外Ca2+超载，激活蛋白水解酶，引起蛋白质、DNA、RNA分解，导致细胞功能失常直至死亡[12]。已有实验证明，胆汁酸可以使体外培养的鼠肝细胞发生凋亡。Li等[13]体外培养鼠肝细胞2 h时分别将不同剂量(25、50、100、200、300 mol)的GCDCA加入培养基，结果显示鼠肝细胞表现出典型的凋亡形态学及生化学变化，且呈浓度依赖和时间依赖效应。GCDCA引起凋亡的机制是通过配体非依赖性Fas受体激活触发的，Caspase-8、组织蛋白酶B和蛋白激酶C参与其中[14,15]。

本研究肝移植术后14天，ITBL组肝汁中GDCA、GCA、GDCA、TLCA、GCDCA水平均较N-ITBL组升高；ROC曲线分析结果显示，术后第14天胆汁中GCDCA水平对判断肝移植术后发生ITBL的AUC为0.751、14天TLCA的AUC为0.764，术后第7天GCA的AUC为0.717，提示GCDCA、GCA、TLCA可能是预测肝移植患者术后3个月内发生ITBL的可靠指标，其中敏感性最高的是术后第14天胆汁中TLCA水平，特异性最高的是术后第7天胆汁中GCA水平。但由于本研究样本量较小，在大规模样本量研究中是否支持以上结论还需进一步研究。

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Bile acid level in the bile of patients within 14 days after liver transplantation and its predictive value for occurrence of ischemic-type biliary lesions

SUNXiaoye1,KANGYongzhen,SHENZhongyang

(1TianjinFirstCenterHospital,Tianjin300192,China)

Abstract:ObjectiveTo detect the levels of bile acids in the bile of patients within 14 days after liver transplantation and to investigate their predictive value for the occurrence of ischemic-type biliary lesion (ITBL). MethodsThirty-nine orthotopic liver transplant patients were selected. Using LC-MSMS to detect the contents of six kinds of bile acids including glycocholic acid (GCA), taurocholic acid (TCA), TLCA, glycochenodeoxycholic acid (GCDCA), glycine combined with deoxycholic acid (GDCA) and taurine combined with deoxycholic acid(TDCA) on day 1, 3, 7 and 14. They were followed up for three months after surgery, and then we determined whether ITBL occurred according to cholangiography results which served as gold standard, and compared the content of each bile acid on day 1, 3, 7 and 14 between patients with ITBL (ITBL group) and patients without ITBL (N-ITBL group). We used ROC curve to assess the predictive value of bile acids for the occurrence of ITBL. ResultsOn day 1, the content of GDCA was lower in the ITBL group than that in the N-ITBL group; on day 7, the contents of GCA and GDCA were higher in the ITBL group than those in the N-ITBL group; on day 14, the contents of TLCA, GCDCA and GDCA were higher in the ITBL group than those in the N-ITBL group, and significant difference was found between these two groups (all P<0.05). Analysis results of ROC carve showed that the AUC of GCDCA on day 14 for the occurrence of ITBL was 0.751, AUC of GCA on day 7 was 0.717, and AUC of TLCA on day 14 was 0.764. ConclusionThe contents of GCDCA, GCA and TLCA within 14 days after liver transplantation are increased and they all can be used as reliable indexes to predict whether ITBL occurs within 3 months after surgery.

Key words:liver transplantation; bile acid; ischemic-type biliary lesions

(收稿日期：2016-01-20)

中图分类号：R657.3

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)12-0005-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.002

通信作者简介：沈中阳(1962-)，男，主任医师，主要研究方向为肝脏移植。E-mail: zhongyangshen@vip.sina.com

第一作者简介：孙晓叶(1975-)，女，副主任医师，主要研究方向为肝脏移植。E-mail: sxy_tj@163.com

基金项目：国家高技术研究发展计划(2012AA021001)；国家临床重点专科建设项目(201354408)；天津市卫生局攻关项目(12KG103)。