王 震，魏玉杰，赖 斌，刘惠亮

焦油、尼古丁和瑞舒伐他汀对人脐静脉内皮细胞表达内皮细胞蛋白C受体的影响

王 震，魏玉杰，赖 斌，刘惠亮

目的 探讨焦油、尼古丁和瑞舒伐他汀对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）表达内皮细胞蛋白C受体（endothelial cell protein C receptor,EPCR）的影响。方法 体外分离培养HUVECs并传代至4～6代，将其分为对照组，50 mg/L焦油组，10-4mol/L尼古丁组，10-5mol/L瑞舒伐他汀组。各组分别孵育6 h和24 h后，收集细胞，使用流式细胞术和实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分别检测并比较细胞EPCR蛋白表达和胞浆中信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）水平。结果 （1）与同时间点对照组比较，EPCR蛋白表达在焦油组孵育6 h（t=29.513，P＜0.001）及24 h（t=41.759，P＜0.001）后均明显上调，差异有统计学意义；而尼古丁组、瑞舒伐他汀组均无明显变化。（2）与同时间点对照组相比，mRNA表达量在焦油组孵育6 h（t=20.753，P＜0.001）和24 h（t=19.897，P＜0.001）后均明显增加；而尼古丁组、瑞舒伐他汀组均无明显变化。结论 焦油可上调HUVECs表面EPCR的表达，而尼古丁和瑞舒伐他汀对EPCR的表达无影响。

焦油；尼古丁；瑞舒伐他汀；内皮细胞蛋白C受体

EPCR是存在于细胞膜表面的跨膜蛋白，可与蛋白质C特异性结合后将其呈递给邻近的凝血酶/血栓调节蛋白复合物，从而加快蛋白质C的激活。吸烟作为冠心病的危险因素之一，近年有研究发现香烟烟雾提取物可引起可溶性EPCR含量升高及膜联EPCR mRNA减少，导致机体凝血功能障碍，血栓形成[1]。但香烟中所含物质种类较多，具体是哪些成分影响了EPCR的表达尚未见报道。作为香烟主要有害组分之一，尼古丁可在吸烟者的血清中检测到，Fahim等[2]发现尼古丁可促进小鼠脑部微血管内血栓形成。既往研究发现降低香烟中焦油的含量，可使冠心病发病风险降低，但亦有其他研究未发现这一效应[3]，故焦油在冠心病发生发展中的作用有待进一步研究。此外有研究表明，他汀类药物除具有降脂作用外，还有抗凝作用[1,4]。故本研究拟选用尼古丁、焦油、瑞舒伐他汀孵育HUVECs，以探索三者对HUVECs 表面EPCR表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 HUVECs取自武警某部三甲医院妇产科，焦油（中国科学院烟草研究所），瑞舒伐他汀（中国军事医学科学院微生物流行病研究所），尼古丁（美国Sigma公司），内皮细胞培养液（endothelial cell medium，ECM） （北京裕恒丰科技有限公司），胎牛血清（fetal calf serum，FBS） （美国Hyclone公司），胰蛋白酶和I型胶原酶（美国Gibco公司），羊抗鼠IgG FITC抗体、鼠抗人EPCR抗体（英国abcam公司），RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]，反转录试剂盒及qRTPCR试剂盒（日本TaKaRa公司），内参β-actin和引物（上海生工生物工程公司）。

1.2 方法

1.2.1 焦油溶液、瑞舒伐他汀溶液的制备 10 mg/ml焦油原液：焦油经甲醇溶液溶解后分装，并于4℃保存。将一定量的瑞舒伐他汀原粉倒入盛有双蒸水的烧杯中，使用磁力搅拌器使其完全溶解，最终配置成10-2mol/L溶液，经0.22 μm滤器过滤除菌后于4℃保存。

1.2.2 HUVECs的分离培养与分组 取妇产科剖宫产的无菌脐带，在超净台内进行以下操作：将脐带置于无菌托盘，用生理盐水冲洗干净，于脐带两头找到脐静脉并于一端固定结扎三通管（入口），采用生理盐水经三通管冲洗脐静脉内腔，至出口流出无色透明液体，再于脐静脉另外一端固定结扎另外一个三通管（出口），注入0.1% I型胶原酶，于37℃无菌生理盐水中静置消化20 min后收集消化液，1000 r/min离心5 min后弃上清，加入含10%FBS的ECM，按1×105/ml的密度接种于25 cm2培养瓶中，37℃ 5%CO2孵箱内培养。待细胞融合至90%，吸出培养液，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，以1×105/ml的密度接种至6孔板孵育过夜，并随机分为4组：空白对照组，50 mg/L焦油组，10-4mol/L尼古丁组，10-5mmol/L瑞舒伐他汀组，每组设3个平行复孔，均孵育6 h和24 h，实验重复3次。

1.2.3 流式细胞术 提取六孔板内细胞，按试剂盒步骤说明操作：（1）分组培养结束后，弃培养液，加入750 μl 0.25%胰酶消化细胞，加入2 ml含1%FBS磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）吹打细胞至悬浮状态，转移至流式管；（2）500 r/min离心5 min，使用含1%FBS的PBS洗涤两次，离心后弃上清加入抗体稀释液；（3）每管加入1 μl鼠抗人EPCR单克隆抗体，手指轻弹流式管底部混匀细胞，4℃避光静置30 min；（4）1%FBS的PBS洗涤两次后，加入抗体稀释液和1 μl羊抗鼠IgG FITC二抗，手指轻弹流式管底部混匀细胞，4℃避光静置30 min；（5）1%FBS的PBS洗涤两次，加入300 μl含1%FBS的PBS，使用流式细胞仪检测细胞表面EPCR的表达，每次计数30 000个细胞，实验重复3次。1.2.4 qRT-PCR 提取六孔板内细胞mRNA，经紫外分光光度计测定样品的浓度和纯度（A260/A280=1.8～2.0）。EPCR上游引物5'-CACCCTGCAGCAGCTCAATGC-3'，下游引物5'-ACATCGCCGTCCACCTGTGC-3'，β-actin 上游引物5'- GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3'，下游引物5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'。qRT-PCR反应条件：95℃（5 min）预变性；95℃（15 s），55℃（20 s），72℃（20 s）运行40个循环；95℃（15 s），59℃（1 min）溶解曲线。采用美国ABI公司实时荧光定量PCR仪VIIA7配套软件进行数据采集，各组结果以公式2-ΔΔCT表示相对表达量，每组设立3个平行复孔，实验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS软件包进行统计分析，计量资料以±s表示，各组与同时间点对照组比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 尼古丁、焦油和瑞舒伐他汀对EPCR蛋白表达的影响 各组分别孵育6 h和24 h后，与同时间点对照组相比，尼古丁组和瑞舒伐他汀组EPCR蛋白表达均上调，但差异均无统计学意义；而焦油组孵育6 h（t =29.513，P＜0.001）及24 h（t=41.759，P＜0.001）后细胞EPCR蛋白表达均明显上调，差异有统计学意义，见表1。

表1 各组HUVECs表面EPCR细胞阳性表达情况（x ±s；n=3）

2.2 尼古丁、焦油和瑞舒伐他汀对EPCR mRNA表达的影响 使用qRT-PCR定量分析各组EPCR mRNA水平的变化，统计各组2-ΔΔCT值的变化，并设立对照组数值为1。结果如图1所示，分别孵育6 h和24 h后，与同时间点对照组相比，尼古丁组和瑞舒伐他汀组EPCR mRNA含量差异均无统计学意义；而焦油组孵育6 h（t=20.753，P＜0.001）和24 h（t=19.897，P＜0.001）后mRNA表达量均明显增加，差异有统计学意义。

图1 各组人脐静脉内皮细胞内EPCR mRNA相对水平比较注：与同时间点对照组相比，①P＜0.05

3 讨 论

蛋白C抗凝系统在人体内发挥着重要作用，其中EPCR参与蛋白C激活和活化蛋白C所介导的蛋白酶活化受体的激活，从而发挥相应的细胞效应[5]。此外，亦有研究表明EPCR可与活化的VII因子结合，发挥内皮细胞间屏障保护功能[6]。EPCR可表达于血管内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞等[7]。作为人体较易获得的细胞种类之一，Lee等[8]使用乌茸菌提取物polyozellin探讨其对HUVECs表面EPCR脱落的影响，樊芳芳等[1]亦使用HUVECs探讨香烟提取物对EPCR表达的影响，因此本研究选用HUVECs作为实验细胞。

Zhang等[9]使用0.01～100 μmol/L尼古丁分别孵育HUVECs 0、8、24 h，发现尼古丁可明显促进HUVECs增生，且呈时间和浓度依赖性，因而本研究直接选用10-4mol/L尼古丁孵育HUVECs，并选择6、24 h两个时间点，但发现尼古丁对EPCR的表达无影响，而焦油可上调EPCR的表达，从而可能增强人体的抗凝作用，这与吸烟易致血栓形成的结论不一致[10]，因此其上调效应是短期保护反应还是长期效应仍需进一步研究验证。至于焦油上调EPCR表达的具体机制，既往研究表明，葡萄糖和转录因子Fli1的基因敲除均可调节HUVECs表面EPCR表达[11]；丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）也可能参与了其表达调节，其中脂多糖可通过P38 MAPK通路下调EPCR表达[12]；肿瘤坏死因子α等细胞因子可能通过增加c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） MAPK下调EPCR的表达[13]。但焦油是否也通过该通路或其他信号通路上调EPCR仍有待研究。

他汀类药物因其降脂作用而被临床广泛应用于冠心病等疾病的治疗，但随着研究深入，Yang等[14]发现他汀类药物可通过上调Krüppel样转录因子的表达而上调血栓调节蛋白的表达，发挥抗凝作用。Landsberger等[15]使用10-8～10-5mol/L瑞舒伐他汀孵育HUVECs 8～12 h后，发现内皮型一氧化氮合成酶表达明显增加，且与瑞舒伐他汀的浓度呈正相关。故本研究选用10-5mol/L瑞舒伐他汀分别孵育内皮细胞6、24 h，但EPCR的表达量均无明显变化，这与文献[1]的研究结果有所矛盾，可能是不同他汀因分子结构差异较大，导致其降脂以外的多效性有所差别，亦有可能是因孵育时间较短，EPCR的表达所需时间不足，该结论仍需进一步验证。

综上所述，本研究发现焦油可上调EPCR的表达，而尼古丁和瑞舒伐他汀对EPCR的表达无影响，该结论与吸烟是心血管疾病的危险因素这一点不符，这可能是内皮细胞的急性应激保护，具体机制有待进一步研究。此外，因时间有限，本研究未深入探索EPCR的表达是否受尼古丁、焦油和瑞舒伐他汀的浓度及孵育时间的影响，今后的研究中需进一步验证。

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（2016-01-07收稿 2016-03-08修回）

（责任编辑 付 辉）

Effects of tar,nicotine and rosuvastatin on expression of EPCR in human umbilical vein endothelial cells

WANG Zhen,WEI Yujie,LAI Bin,and LIU Huiliang.Department of Cardiology,General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces,Beijing 100039,China

LIU Huiliang,E-mail:huiliangl531@163.com

Objective To explore the effects of tar,nicotine and rosuvastatin on expression of endothelial cell protein C receptor (EPCR)in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods HUVECs were isolated and cultured in vitro,and were randomly divided into control group,50 mg/L tar group,10-4mol/L nicotine group,10-5mol/L rosuvastatin at passage 4 to 6.All groups were incubated for 6 h and 24 h,then collected the HUVECs.Flow cytometry and quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR)were respectively used to detect and compare expression of EPCR protein and the EPCR level of messenger ribonucleic acid (mRNA)of in each HUVECs group.Results (1)Compared with control group at the same time point,expression of EPCR protein in 50 mg/L tar group after incubated for 6 h (t=29.513，P＜0.001)and 24 h (t=41.759，P＜0.001)were both increased,and the differences were statistically significant;but in 10-4mol/L nicotine group and 10-5mol/L rosuvastatin group had no obvious change.(2)Compared with control group at the same time point,expression of EPCR mRNA in 50 mg/L tar group after incubated for 6 h (t=20.753，P＜0.001)and 24 h (t=19.897，P＜0.001)were significantly increased;but there were no significant change in 10-4mol/L nicotine group and 10-5mol/L rosuvastatin group.Conclusions Tar has the effect of up-regulating the expression of EPCR in HUVECs,whereas nicotine and rosuvastatin have no effect on the expression of EPCR in HUVECs.

tar;nicotine;rosuvastatin;endothelial cell protein C receptor

R363

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.04.005

王 震，硕士研究生在读，E-mail:wzlunwen@126.com

100039 北京，武警总医院心内科

刘惠亮，E-mail:huiliangl531@163.com