马明兰，刘　阳，蔡丽娜，张　琳，谭珺隽

(武昌理工学院 湖北省生物多肽糖尿病药物工程技术研究中心，湖北 武汉 430223)



桑葚多糖的提取研究

马明兰，刘阳，蔡丽娜，张琳，谭珺隽

(武昌理工学院 湖北省生物多肽糖尿病药物工程技术研究中心，湖北 武汉 430223)

摘要：采用沸水浸提法提取桑葚多糖，用醇沉法析出粗多糖后利用5%三氯醋酸脱蛋白纯化得精制桑葚多糖。通过正交实验确定最佳提取工艺条件为：料液比1∶6(mg∶mL)，浸提时间0.5 h，乙醇浓度90%，优化的5%三氯醋酸脱蛋白液料比为875∶1(mL∶g)。在最佳提取工艺条件下进行20倍放大实验，精制桑葚多糖提取率可达2.63%。采用苯酚-硫酸法对桑葚多糖含量进行测定，以葡萄糖溶液为对照品溶液，在490 nm处测得吸光度与浓度线性关系良好(R=0.9997)；测定溶液在3 h内稳定性良好(RSD=1.02%)，重复性良好(RSD=1.22%)，回收率平均值为99.67%(RSD=0.93%)。该测定方法线性、精密度、准确度均满足测定要求，并且方法简单、成本低，值得广泛应用。

关键词：桑葚多糖；提取；醇沉法；苯酚-硫酸法；含量测定

桑葚是一种具有较高营养与药用价值的食品，也是我国传统的中草药，具有滋阴补血、抗氧化、生津、润肠、降血糖和降血压的功效[1]，主要含有桑葚多糖、芦丁、白黎芦醇、蘜酸、原花色素、维生素和挥发油[2]。现代药理学认为，桑葚多糖具有降血糖、抗氧化等多种潜在的药用价值。从桑葚中提取多糖并将其制成经济效益高的降糖药物或保健品，能充分发挥我国丰富的桑葚等药用植物资源优势，造福大众健康。作者采用沸水浸提法提取桑葚多糖，并优化了提取工艺条件。

1实验

1.1材料、试剂与仪器

桑葚，购于湖北中医药大学医药店。

葡萄糖对照品，中国药品生物制品检定所；石油醚、95%乙醇、无水乙醇、无水乙醚、无水丙酮、三氯醋酸、浓硫酸、苯酚，均为国产分析纯。

UV-1800型紫外可见分光光度计，日本岛津；BT224S型电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器、RE-201C型旋转蒸发仪，巩义予华仪器有限责任公司；J-26XP型高速冷冻离心机，贝克曼库尔特商贸中国有限公司。

1.2方法

1.2.1多糖的提取

桑葚→除杂质→烘干→捣碎→称量→石油醚脱脂1h→冷却抽滤→沸水浸提→旋转浓缩→醇沉过夜→抽滤→粗多糖。

在单因素实验的基础上，选择对多糖提取率影响较大的料液比(A)、浸提时间(B)、乙醇浓度(C)为考察因素，以桑葚多糖提取率为考核指标，进行正交实验优化提取工艺，正交实验的因素与水平见表1。

表1

正交实验的因素与水平

Tab.1

The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.2多糖的精制

将粗多糖分别用无水乙醇、无水乙醚、无水丙酮洗涤3次，然后加入一定量的5%三氯醋酸除去蛋白，离心，取上清液，再浓缩，加入乙醇使其含量达到80%，放入冰箱静置12 h，离心，干燥，得精制桑葚多糖，测定多糖含量。

1.2.3桑葚多糖含量的测定

1.2.3.1标准曲线的绘制

精密称取葡萄糖对照品10.03 mg置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，得浓度为0.1003 mg·mL-1的葡萄糖对照品溶液，分别取0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL葡萄糖对照品溶液，分别加蒸馏水2.0 mL、1.8 mL、1.7 mL、1.6 mL、1.5 mL、1.4 mL，摇匀，再分别精密加入刚配制的5%苯酚溶液1 mL，摇匀，分别缓慢滴加浓硫酸5 mL，边滴加边振荡，然后在40 ℃水浴中加热30 min，冷却，以空白试剂作参比，在400～550 nm波长范围内扫描，以最大吸收峰处波长(490 nm)作为测试波长，测定吸光度(A)，绘制A-c标准曲线。

1.2.3.2桑葚多糖含量的测定

精密称取桑葚多糖0.1 g，加100 mL水溶解，再稀释20倍，按照苯酚-硫酸法测定吸光度，以空白试剂作参比，在490 nm处测定A。根据标准曲线计算桑葚多糖浓度，进而计算桑葚多糖提取率[3]。

1.2.4方法学评价

1.2.4.1稳定性

精密量取一定量的桑葚多糖溶液，按照与标准曲线相同操作，分别在490 nm处间隔0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min测定A，计算RSD。

1.2.4.2精密度

精密量取6份等体积的桑葚多糖溶液，按照与标准曲线相同操作，测定A，计算RSD。

1.2.4.3准确度

精密称取桑葚多糖0.025 g和葡萄糖对照品0.050 g、桑葚多糖0.050 g和葡萄糖对照品0.050 g、桑葚多糖0.075 g和葡萄糖对照品0.050 g各3份，混匀，按照1.2.3.2的方法配制样品待测液，混匀，按照标准曲线相同操作，分别测定A，计算回收率。

2结果与讨论

2.1正交实验结果(表2)

表2

正交实验结果与分析

Tab.2The results and analysis of orthogonal experiment

实验号ABC多糖提取率/%1#1113.172#1221.893#1331.384#2124.215#2232.916#2313.957#3133.588#3211.959#3323.25k12.1453.6533.006k23.6892.2323.116k32.9112.8602.623R1.5441.4210.493

由表2可知，各因素对多糖提取率影响大小顺序为：料液比>浸提时间>乙醇浓度，最佳提取工艺条件为A2B1C2，即料液比1∶6(mg∶mL)、浸提时间0.5 h、乙醇浓度90%。在最佳提取工艺条件下，重复实验2次，多糖提取率分别为4.16%、4.30%，与正交表中4#实验提取率4.21%比较，平均值为4.22%，RSD值为1.68%，说明提取工艺稳定。

将该工艺放大20倍，取干桑葚200 g实验，多糖提取率为4.63%。和小试数据相比，放大实验提取率相对较高，这可能是因为放大后，称量及实验误差降低，这不影响最佳工艺路线的选择。

2.2精制实验结果

取放大实验得到的桑葚多糖粗品进行精制实验，测定桑葚多糖含量，结果见表3。

由表3可知，5%三氯醋酸量为取样量的875倍时，去蛋白效果最佳，桑葚多糖含量最高，为72.02%。依照该方案对放大实验剩余样品进行去蛋白操作，最终制得桑葚多糖含量为73.18%，与上述实验数据基本吻合，因此确定该工艺为去蛋白最佳工艺。

2.3多糖含量测定结果

按照1.2.3的测定方法，测定并绘制葡萄糖标准曲线，见图1。

拟合线性回归方程为y=0.0079x+0.0692(R=0.9997)，说明葡萄糖浓度在20.06～60.18 μg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好，可用于桑葚多糖含量的测定。

表3

去蛋白实验结果

Tab.3

The results of deproteinization

图1葡萄糖的标准曲线

Fig.1The standard curve of glucose

精制各次所得桑葚多糖粗品，测定其桑葚多糖含量，计算桑葚多糖提取率，结果见表4。

表4

多糖含量和提取率的测定结果/%

Tab.4

The results of content and extraction rate of polysaccharide/%

注：1#～9#是正交实验编号，平行1、2为最佳条件下的实验。

2.4方法学评价结果

2.4.1稳定性(表5)

由表5可知，180 min内测定7次的吸光度的平均值为0.388，RSD为1.02%，表明稳定性良好。

2.4.2重复性(表6)

由表6可知，6次测定的多糖含量平均值为35.68%，RSD为1.22%，表明重复性良好。

2.4.3准确度(表7)

由表7可知，方法的回收率平均值为99.67%，RSD为0.93%，表明该方法的准确度良好。

表5

溶液稳定性实验结果

Tab.5

The results of solution stability experiment

表6

重复性实验结果

Tab.6

The results of repeated experiment

3结论

采用沸水浸提法提取桑葚多糖，确定优化的工艺条件为：料液比1∶6(mg∶mL)，浸提时间0.5 h，乙醇浓度90%，5%三氯醋酸去蛋白最佳液料比为875∶1(mL∶g)。在最佳提取工艺条件下进行20倍放大实验，并对所得桑葚多糖进行精制，多糖提取率可达2.63%。

采用苯酚-硫酸法进行桑葚多糖含量测定，以葡萄糖溶液为对照品溶液，在490 nm处测得吸光度与浓度线性关系良好(R=0.9997)；测定溶液在3 h内稳定性良好(RSD=1.02%)，重复性良好(RSD=1.22%)，回收率平均值为99.67%(RSD=0.93%)。该测定方法线性、精密度、准确度均满足测定要求，并且方法简单、成本低，值得广泛应用。

表7回收率实验结果

Tab.7

The results of recovery experiment

参考文献：

[1]王强，王睿，王存，等.桑葚多糖调节血糖代谢及体外抗氧化效果研究[J].食品科学，2014，35(11)：260-264.

[2]刘玉玲，纪国力.桑葚中多糖的提取及含量的测定[J].中国医药科学，2012，2(18)：109-110.

[3]郑晓艳，林艺华.中药多糖的提取、分离纯化及其含量测定方法概述[J].福建分析测试，2013，22(4)：58-62.

Extraction and Content Determination of Mulberry Polysaccharide

MA Ming-lan,LIU Yang,CAI Li-na,ZHANG Lin,TAN Jun-jun

(EngineeringTechnologyResearchCenterofBiologicalPeptideAntidiabeticsofHubeiProvince,WuchangUniversityofTechnology,Wuhan430223，China)

Abstract：Mulberry polysaccharide was extracted by hot water extraction,crude polysaccharide was obtained by alcohol precipitation method,and protein was further removed by 5% trichloroacetic acid to prepare purified mulberry polysaccharide.Through an orthogonal experiment,the optimal conditions of extraction were as follows:solid-liquid ratio of 1∶6(mg∶mL),extraction time of 0.5 h,ethanol concentration of 90%,and 5% trichloroacetic acid with liquid-solid ratio of 875∶1(mL∶g) to deprotein.For 20 times scale-up experiment,the extraction rate of purified polysaccharide could reach 2.63%.Mulberry polysaccharide content was determined by a phenol-sulfuric acid method.Using glucose solution as the reference substance solution,there was a good linear relationship(R=0.9997) between the absorbance at 490 nm and the concentration,the solution had good stability within 3 h(RSD=1.02%),It had good repeatability(RSD=1.22%),and the average recovery rate was 99.67%(RSD=0.93%).This method meets the requirements of linearity,precision and caauracy,and the method is simple,low-cost and with wide applications.

Keywords：mulberry polysaccharide;extraction;alcohol precipitation method;phenol-sulfuric acid method;content determination

基金项目：湖南省环保厅资助项目(湘财建指[2014]287号)，湖南农业大学东方科技学院大学生研究性学习和创新性实验计划项目(DFCXY201308)

中图分类号：R 284.2

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)03-0039-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.011

作者简介：马明兰(1982-)，女，湖北宜昌人，实验师，研究方向：化学合成，E-mail：yuebianxing82@163.com。

收稿日期：2015-10-30