刘文彬,　郭辉力,　刘　欢,　黄丽娜,　张奋强,　马兰青*

1.北京农学院植物科学技术学院, 北京 102206;

2.北京农学院生物科学与工程学院, 农业部都市农业(北方)重点实验室, 北京 102206



烟草Nt4CL与虎杖PcSTS基因的融合表达与功能分析

刘文彬1,郭辉力2,刘欢1,黄丽娜2,张奋强1,马兰青2*

1.北京农学院植物科学技术学院, 北京 102206;

2.北京农学院生物科学与工程学院, 农业部都市农业(北方)重点实验室, 北京 102206

摘要：4-香豆酰辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase, 4CL)和芪合酶(stilbene synthase, STS)是白藜芦醇苯丙氨酸代谢合成的最后两个关键酶。运用悬挂PCR(overlap PCR)的方法将烟草4CL基因(Nt4CL)和虎杖STS基因(PcPKS5)用3个中性氨基酸链连接，得到融合基因Nt4CL-PcPKS5，将其插入原核表达载体中，构建pET30a-Nt4CL-PcPKS5重组质粒，表达Nt4CL-PcPKS5融合蛋白。经Ni(2+)纯化和PD-10柱脱盐后，得到可溶性纯化蛋白。体外酶促反应结果表明该融合酶具有4CL和STS的双重活性，其催化产物为白藜芦醇。酶促反应最适条件为：pH 6.5，反应温度为45℃。研究结果获得了有效催化白藜芦醇生物合成的双功能融合酶，为进一步利用融合酶基因转化工程菌株实现白藜芦醇工业化生产奠定了基础。

关键词：白藜芦醇；融合基因；原核表达；酶促反应

白藜芦醇(resveratrol)是植物在受到生物或非生物胁迫时产生的一种能够提高植物病原抗性和环境恶化的植物次生代谢产物，主要存在于各种浆果、花生以及虎杖(Polygonumcuspidatum)中[1]。日本学者Tokaoka在1940年首次从毛叶藜芦(VeratrumgrandiflorumLoes.)中分离获得[2]，随后在虎杖根茎中分离出来[3]。1976年，白藜芦醇作为一种植物自身产生的抗逆物质在葡萄叶片中被发现[4]。目前已知白藜芦醇主要存在于葡萄、桑椹、花生、买麻藤、桉树、大黄等12科、31属72种植物中，以葡萄属植物中最多。……