张杨,邱祖明,吴顺清 (荆州文物保护中心技术研究部,湖北荆州434020)吴刚珂,任贻军许航,毛毓华(长江大学荆州临床医学院荆州市中心医院检验医学部,湖北荆州434020)



湖北凤凰山西汉古尸保存液中氨基酸含量研究

张杨,邱祖明,吴顺清 (荆州文物保护中心技术研究部,湖北荆州434020)
吴刚珂,任贻军许航,毛毓华
(长江大学荆州临床医学院荆州市中心医院检验医学部,湖北荆州434020)

[摘要]湖北江陵凤凰山168号汉墓西汉古尸从出土后一直采用12.5%浓度福尔马林液体保存,到现在已近40年。为了了解古尸保存状况,采用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS)对尸体和内脏保存液中的17种氨基酸含量进行了研究。结果表明:从两种保存液中均检测出了微量的氨基酸,氨基酸的检出说明西汉古尸机体蛋白质出现了化学降解,导致其显微结构出现了损伤,对古尸的长久保存不利。该分析结果为古尸保存液的研究和配制提供了参考。

[关键词]西汉古尸；保存液；氨基酸；超高效液相色谱-质谱仪

[引著格式]张杨,邱祖明,吴顺清,等.湖北凤凰山西汉古尸保存液中氨基酸含量研究[J].长江大学学报(自科版),2016, 13(6):7～11.

1975年6月8日,我国文物考古工作者在湖北荆州楚故都纪南城内发掘了凤凰山168号西汉墓。该墓葬不仅出土了一批珍贵文物,还出土了一具保存完好的西汉古尸。根据墓中的竹牍记载,死者下葬于文帝十三年,即公元前167年,距发掘出土已有2142年,是当时我国发现的时代最早的一具古尸。出土时古尸的整体外观和各内脏器官的大体形态以及软骨、骨骼肌、结缔组织等组织结构保存完好,软骨细胞清晰可见,结缔组织胶原纤维保存着十分完好的超微形态和分子结构[1]。

古尸从1975年出土到现在一直保存在自配的保存液中,当保存液由于多种原因消耗后,进行一定量的补充,使其保持在一定水平。古尸出土后,尚未对保存液中氨基酸的含量进行分析检测,鉴于此,本研究采用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS)对尸体和内脏保存液中的氨基酸含量进行了分析检测,以便于了解古尸保存情况,为改良保存液提供依据,以利于古尸长久保存。

1　材料与方法

1.1样品

本次分析的保存液分别来源于浸泡尸体和内脏的保存液,保存尸体的称为尸体保存液(Corpse preservationsolution,CPS),用来浸泡内脏的称为内脏保存液(Visceralpreservationsolution,VPS)。

1.2仪器和试剂

超高效液相色谱,型号:ACQUITY,产地:美国Waters公司；三重四极杆质谱仪,型号:Xevo TQD,产地:美国Waters公司；高速冷冻离心机,型号:3K15,产地:德国SIGMA公司；漩涡混匀器,型号:QT-2,产地:上海琪特分析仪器有限公司。

甲酸,质谱用,批号:W09011204,美国Waters公司；乙腈,色谱纯,批号:1651130232,德国Merck公司；氨基酸标准品均购自于中国食品药品检定研究院,丙氨酸(140680-201303)、精氨酸(140685-201305)、门冬氨酸(140691-200401)、胱氨酸(140632-200502)、谷氨酸(140690-201203)、甘氨酸(140689-201103)、组氨酸(140693-201102)、异亮氨酸(140683-200401)、亮氨酸(140687-201102)、甲硫氨酸(140684-201102)、苯丙氨酸(140676-200405)、脯氨酸(140677-201206)、丝氨酸(140688-201102)、苏氨酸(140682-200401)、色氨酸(140686-201303)、酪氨酸(140609-201212)、缬氨酸(140681-201202)；纯净水,批号:2122YC,杭州娃哈哈集团有限公司。

表1　氨基酸质谱其他监测条件

1.3LC-MS/MS条件

1)色谱条件 超高效液相色谱分析柱,CAPCELL PAKC18(2.0mm×100mm,5μm),产地:日本资深堂；流动相A:乙腈,流动相B:0.02%甲酸,梯度洗脱:0～3min,2%流动相A:98%流动相B, 3～10min,2%流动相A～5%流动相A:98%流动相B～95%流动相B,10～12min,5%流动相A～2%流动相A:95%流动相B～98%流动相B；流速:0.20mL/min；进样体积:5μL；柱温:20℃。

2)质谱条件 电喷雾离子源(ESI),正离子扫描；质谱多反应监测(multiplereactionmonitoring, MRM)扫描分析；毛细管电压3300V；离子源温度350℃；雾化气和脱溶剂气均为氮气,碰撞气为氩气；脱溶剂气温度150℃,流速650L/h；质谱选择反应监测其他条件见表1。选取色氨酸(Try)标准溶液提取离子色谱图见图1。

图1　Try标准溶液提取离子色谱图

1.4样品处理方法

分别吸取CPS,VPS各5mL移至带盖塑料离心管中,涡旋混匀2min,以15000rpm高速离心3min,吸取上清液供超高效液相色谱—质谱进样分析。

2　结果

2.1线性关系

将17种氨基酸混合标准溶液稀释成0.20、0.50、1.0、2.0、5.0、10.0μmol/mL系列浓度溶液,测定后以峰面积为纵坐标,以氨基酸的浓度为横坐标,进行线性回归,得到线性方程和相关系数,结果表明在该浓度范围内17种氨基酸均呈现良好的线性关系,同时将氨基酸标准溶液稀释后检测,得到各氨基酸的检测限(见表2)。

2.2精密度

将17种氨基酸混合标准溶液稀释成5.0、1.0、0.20μmol/mL三个浓度,依次连续进样6次,计算各氨基酸峰面积的相对标准偏差(RSD)值,结果见表3。

2.3稳定性

取1.0μmol/mL的17种氨基酸混合标准溶液分别在室温条件下于0、2、4、6、12、24h进样测定,计算RSD值,结果表明氨基酸在24h内较稳定(见表4)。

2.4回收率

分别配制浓度为6μmol/mL、1μmol/mL、0.3μmol/mL的氨基酸标准溶液进行回收率试验,进样分析6次后计算平均回收率及RSD,结果见表5～表7。

表2　17种氨基酸线性范围

表3　17种氨基酸各浓度下精密度(n=6)

表4　17种氨基酸的稳定性(n=6)

表5　氨基酸标准溶液(6μmol/mL)回收率

2.5检测结果

本次样品检测各氨基酸浓度见表8。

3　讨论

3.1检测方法学的评估

1958年,Spackman等[1]用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸,氨基酸的分析实现了自动化。此后氨基酸分析的许多新方法相继得到应用[2],目前普遍采用离子色谱法[3,4]、高效液相色谱法[5,6]、液相色谱—质谱法等[7,8]。UPLC保持了高效液相色谱的基本原理,其理论依据于VanDeemter经验方程[9],随色谱柱中装填固定相粒度的减小,色谱柱的理论塔板高度也小,色谱柱的柱效越高,并可获得更宽的线速度范围,达到分离分析的高速、高效和高灵敏度。为此, UPLC在技术上实现了各个关键环节系统性的优化创新和组合[10]。UPLC-MS技术是目前用于定量检测氨基酸最好的质谱技术,根据氨基酸母离子质量数与碎片离子质量数,选择母粒子—子离子对,允许符合要求的子离子进入碰撞室,碰撞结束后,只记录设定子离子信号,通过母粒子与子离子的两次选择,去除干扰离子,降低化学背景,提高灵敏度。在分析化学领域,这种质谱扫描模式已成熟运用于复杂体系的小分子化合物分析[11]。

表6　氨基酸标准(1μmol/mL)溶液回收率

表7　氨基酸标准溶液(0.3μmol/mL)回收率

流动相的选择分别考察了以0.2%、0.1%、0.05%、0.02%甲酸与乙腈配比作为流动相,结果发现各氨基酸峰面积差别不大,随着甲酸浓度的降低,各氨基酸的保留时间提前,故甲酸的浓度选择为0.02%。在考察流动相比例时,先用0.02%甲酸乙腈(96∶4)时发现Phe与Try保留时间较长,出峰时间较晚,经反复试验选用实验中的梯度洗脱方法,各氨基酸峰形较好、保留时间适合。

表8　各氨基酸检测结果

17种氨基酸标准品在所选择的条件下完全分离,峰型比较对称,干扰也小,说明在此条件下各氨基酸能够得到很好的分离,对处于相同条件下的CPS、VPS也能得到理想的结果。表2～5显示17种氨基酸浓度与峰面积呈良好的线性关系,线性范围0.2～10μmol/mL,最小检出限为0.005～0.5μmol/mL,相关系数均在0.998以上,精密度RSD (5.0μmol/mL)在0.71%～3.98%之间,回收率(6.0μmol/mL)在90.63～102.93%之间,氨基酸在24h内较稳定。此法具有操作简便易行、准确度高、重现性好等优点。

人体内所有蛋白质都是由20种氨基酸组成的多聚体,由于本次购买的氨基酸标准品只有17种,所以提供17种氨基酸检测数据。

3.2氨基酸的含量探讨

蛋白质是生命活动的基础,其分子组成有一定的规律性,氨基酸是构成蛋白质的基本单位,是生物体的基本组成成分之一,也是生物体中含量最丰富的生物大分子[12]。氨基酸具有碱性的α-氨基和酸性的α-羧基,可在酸性溶液中与质子(H+)结合呈带正电荷的阳离子(—NH3+),也可在碱性溶液中与OH—结合,失去质子变成带负电荷的阴离子(—COO—),具有两性解离的特性[12]。氨基酸的解离方式取决于其所处溶液的酸碱度[12]。从表6.检测结果可看出,CPS和VPS检出浓度最高的2种均是Ala、Asp,均未检出的有7种分别是Cys、His、Met、Pro、Ser、Try、Tyr,在VPS中另有3种未检出,分别是Lle、Leu和Val,未能检出,表明其含量极微或在检测线以下甚至是没有。以上结果表明组织中的氨基酸在目前的条件下不被溶出或溶出量极少,CPS和VPS分别对尸体和内脏起到了较好的保护作用。

童建斌等通过对保存液pH值对马王堆古尸蛋白质保存的影响的研究,结果发现保存液pH值的适当提高有助于降低保存液中总氮量和氨基酸含量,有利于古尸蛋白质的保存[13]。笔者认为,氨基酸具有两性解离的特性,本次检测的17种氨基酸有非极性脂肪族氨基酸如Gly,等电点5.97；极性中性氨基酸如Ser,等电点5.68；芳香族氨基酸如Try,等电点5.89,酸性氨基酸如Asp,等电点2.77；碱性氨基酸如Arg,等电点10.76,无论如何改变保存液的pH,都会偏离部分氨基酸的等电点,从而会导致其解离。我们对CPS和VPS的pH进行了测定,分别为5.35和3.85,其中CPS的pH与其推荐使用的最适pH相近,VPS的pH是否需要调整还有待商榷。张轶霁等用相近方法对血清中20种游离氨基酸含量进行了测定,认为该方法与传统的衍生化氨基酸分析方法相比,具有无需衍生,操作简便,干扰因素少、分析时间短,使用样本量小等特点,线性范围适宜、精密度好、准确度高、灵敏及稳定性好等优点[14]。王一红等利用液相色谱—质谱/质谱联用技术分析18种游离氨基酸后,认为直接测定样品中游离氨基酸,分析速度快,灵敏度高,定性和定量准确,适合各种样品中游离氨基酸的测定[15]。

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[编辑] 一凡

[作者简介]张杨(1970—),男,副研究馆员,硕士,现主要从事皮质文物保护技术研究;通信作者:吴顺清, wsqdx2@263.net。

[基金项目]国家科技支撑计划资助项目(2012BAK14B00)。

[收稿日期]2015—12—16

[中图分类号]R446

[文献标志码]A

[文章编号]1673—1409(2016)—04—0007—05