王乐丹 李文桔 胡越

【摘要】目的：利用噬菌体7肽库进行体外快速差减筛选（biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands，BRASIL），从而获得卵巢癌细胞株HO-8910细胞表面特异性结合肽。方法：以中国仓鼠卵巢细胞株CHO为吸附细胞，卵巢癌细胞株HO-8910为靶细胞，利用噬菌体展示技术联合差减筛选策略，经过连续5轮生物淘洗，随机挑选13个噬菌体单克隆进行DNA测序，利用噬菌体竞争结合实验、ELISA实验、细胞免疫染色、细胞免疫荧光、合成多肽的竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体的亲和性及特异性。结果：筛选出的噬菌体NPMIRRQ与卵巢癌细胞株HO-8910有较高的亲和性及特异性。结论：阳性噬菌体表面展示的多肽NPMIRRQ可能为卵巢癌的早期诊断和转移复发监测提供新思路。

【关键词】卵巢癌；噬菌体展示技术；噬菌体多肽库；体外快速差减筛选技术；多肽

【中图分类号】R737【文献标志码】A

卵巢癌位于妇科恶性肿瘤死亡之首＼[1＼]。据统计，全球每年卵巢癌的发病率达12.7/100000＼[2＼]。目前，临床上主要通过血清CA-125水平和妇科超声检查来诊断卵巢癌。然而，CA-125在多种恶性肿瘤和良性疾病中亦有升高＼[3＼]，其作为卵巢癌诊断指标在灵敏度和特异度方面均存在显著局限，而超声检查也只能起辅助诊断的作用。因缺乏可靠的诊断指标，目前高达75%的卵巢癌患者在确诊时已经为晚期或已发生转移＼[4＼]，其五年生存率更是不足30%＼[5＼]。如何尽早诊断卵巢癌提高患者的生存率成为专家学者们研究的重点问题。

噬菌体展示技术目前被认为是筛选肿瘤细胞表面特异性结合肽的强有力、高通量的一种生物学技术，最先是在1985年Smith等＼[6＼]首先创立并在Science杂志上发表，其将噬菌体随机肽库与靶标吸附，洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体，用宿主菌洗脱结合的噬菌体，进行扩增，经过3～5轮的循环，高度富集与靶分子特异结合的噬菌体，然后进行序列测定，获取其相应的功能、结构等信息。本文以中国仓鼠卵巢细胞株CHO为吸附细胞，以卵巢癌细胞株HO-8910为靶细胞，差减筛选卵巢癌细胞株HO-8910细胞表面分子结合肽，并鉴定其亲和性及特异性，从而获得卵巢癌细胞特异性结合肽，展示利用噬菌体进行卵巢癌诊断的技术。现汇报如下。

1材料与方法

1.1研究材料

1.1.1肽库及试剂选用美国New England Biolabs公司的噬菌体随机肽库（Ph.D-7TM phage Display Peptide library），文库滴度、随机多样性分别为2×1013 pfu/mL、1.28×109。受菌体为E.coli ER2738，-96gⅢ sequencing primer（5-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3）。选用earthox公司的抗M13单抗（GE Healthcare）、HRP-抗M13单抗（GE Healthcare）以及FITC标记的兔抗鼠IgG。

1.1.2细胞来源选自上海拜力生物科技有限公司的卵巢癌细胞株HO-8910，上海中科院的宫颈癌细胞株Hela、胰腺癌细胞株PANC-1以及上海瑞鹿生物科技有限公司的中国仓鼠卵巢细胞株CHO。

1.2方法

1.2.1差减筛选制作DMEM无血清培养液，内含1%BSA，将HO-8910与CHO细胞重悬于其中，至细胞数为1×107/mL时取CHO细胞100μL，其中10μL加至肽库中，调节温度4℃，旋转孵育2h，30 rpm/min。孵育后加入200 μL环己烷、邻苯二甲酸二丁酯分离液中，两者体积比例为1∶9，10000 g、4℃离心10min；吸出水相里未结合的噬菌体肽库与100 μL HO-8910细胞于4℃共同孵育3 h；无菌手术刀片切下EP管的底部，取出有机相内沉淀物，其为能与HO-8910细胞结合的噬菌体，转移沉淀物至新的EP管中；另加入大肠杆菌ER2738 200μL，在37℃下孵育30min，对与HO-8910细胞结合的噬菌体进行复苏。对淘洗后的噬菌体进行测滴度、扩增、纯化，进入下一轮差减筛选。将每一轮淘洗及扩增的噬菌体数记录下来，计算回收率（淘洗前后噬菌体滴度的比值）。

1.2.2DNA测序第五轮淘洗噬菌体的平板中随机选取13个蓝斑，扩增后提取DNA进行DNA序列分析，得出多肽序列。

1.2.3竞争结合实验将所得7种噬菌体进行扩增和纯化，测量其滴度，对照组为M13K07噬菌体。将7种噬菌体分别于M13K07噬菌体1：1混合，滴度为5×109 pfu，混合后置于100μL HO-8910细胞悬液中孵育2h，孵育温度及条件与上述悬液配置相同。2h后将其离心、复苏并测量滴度。由于M13K07噬菌体无lac-Z基因，在LB/IPTG/X-gal平板上呈白斑，而其余7种噬菌体呈蓝斑。记录白斑、蓝斑数目，计算7种噬菌体与HO-8910细胞的相对结合率（蓝斑与白斑的比值）。

1.2.4ELISA实验将HO-8910、PANC-1以及Hela接种于96孔板上，计数为104/孔，温度调节为37℃，过夜培养，使用灭菌PBS进行洗涤后，在无血清培养基上培养1h，使用4%多聚甲醛进行20min固定，将加入5 mg/mL BSA的PBS作为封闭液封闭培养2h。以PBS、M13K07噬菌体为对照组，分别在接种板上加入7种噬菌体克隆1010 pfu/孔），温度为37℃，孵育2h。孵育前均加入封闭液稀释，预先孵育30min排除非特异性结合。加入以1∶6000稀释于封闭液中的HRP-抗M13抗体（200 μL/孔）孵育1h，每孔加入200 μL TMB显色液并孵育1h，设置微板阅读器410nm。

1.2.5细胞免疫染色分别将细胞HO-8910、Hela、PANC-1接种于细胞爬片上，每孔104/0.5 mL培养液，37℃培养过夜；4%多聚甲醛室温固定15 min；封闭液 （含5 mg/mL BSA的PBS）室温封闭20 min；吸去封闭剂，分别加入噬菌体NPMIRRQ和噬菌体M13K07，37℃孵育2 h（1010 pfu/孔），PBS作为阴性对照；加入1∶100稀释的HRP-抗M13抗体，37℃孵育2 h；取下细胞爬片置于载玻片上，加入新鲜配制的DAB显色液，室温下反应2～3 min，在显微镜下监测DAB显色情况；再用苏木素轻度复染细胞核0.5～1 min；脱水、透明、封片，在显微镜下观察阳性着色为棕色颗粒。

1.2.6细胞免疫荧光如“细胞免疫染色”中所述制作细胞爬片，固定，封闭，加入1∶100稀释的抗M13抗体，37℃孵育2 h；加入1∶300稀释的FITC标记的兔抗鼠IgG，37℃ 孵育0.5 h（避光）；加入DAPI（1：5000）常温孵育5 min（避光）；立即在荧光显微镜下观察。

1.2.7合成多肽的竞争抑制实验收集HO-8910细悬液，调整细胞数为1×107/mL；分别将HO-8910细胞与不同浓度的多肽NPMIRRQ或对照肽4℃孵育0.5 h，再与109 pfu噬菌体NPMIRRQ于4℃孵育2 h（旋转，30 rpm/min）；后离心、复苏、测滴度。实验共分为7组，多肽浓度分别是：0 μmol/L、0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L和500 μmol/L，以多肽浓度是0 μmol/L时的噬菌体滴度为100%，计算不同浓度多肽时噬菌体滴度的相对比值。多肽NPMIRRQ和对照肽均由上海生工公司合成。

2实验结果

2.1差减筛选

本文用CHO、HO-8910作为吸附细胞及靶细胞，对7种噬菌体进行差减筛选，计算每轮回收率。可见回收率第一轮为2.5×10-6，到第5轮时增加到2.3×10-4。见表1。

2.7合成多肽的竞争抑制实验

竞争抑制实验显示：多肽NPMIRRQ能抑制噬菌体NPMIRRQ与卵巢癌细胞株HO-8910的结合，呈剂量效应关系，而含相同氨基酸但不同组成顺序的对照肽PMIRRQN则不能抑制噬菌体NPMIRRQ与卵巢癌细胞株HO-8910的结合。见图4、图5。

3讨论

本文展示了噬菌体技术的过程及结果，其优势在于表型与基因型的结合可在不知道靶分子结构的前提下，通过对阳性噬菌体克隆基因的序列检测，推断出外源多肽氨基酸的结构序列＼[7＼]。近几年，一些通过噬菌体肽库筛选技术得到的组织特异性多肽分子以其较好的靶向性、较低的免疫原性、较小的毒副作用以及便于化学修饰，具有较好的药代动力学及组织内分布特性等特征，引起了众多肿瘤学家的关注＼[8＼]。这些多肽分子可与多种类型的标记物分子如同位素、荧光素及量子点等偶联，开发为特异性多肽分子探针，用于多种肿瘤的早期诊断与大范围筛查＼[8-10＼]。

近些年，以肿瘤细胞为靶标，应用噬菌体展示技术在体外已成功筛选到能与不同肿瘤细胞如结肠癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、肺癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌等细胞表面特异性结合的多肽＼[11＼]，但对于卵巢癌的应用研究较少，王世宣等＼[12＼]做过相关报道，使用多肽库进行淘洗筛选后得到能与A2780卵巢癌细胞株结合的YYGLAEVDAGGS短肽。国外学者Zhang等＼[13＼]也经过实验得到能与SK-OV-3卵巢癌细胞株结合的SVSVGMKPSPRP（ZP1）短肽，其认为此短肽可作为靶向诊断和治疗卵巢癌的配体肽段。但这些研究都还只是初步鉴定多肽的亲和性，缺乏特异性方面的研究。

由于肿瘤细胞表面的生物活性分子非常复杂，导致噬菌体与细胞的非特异性结合较高，常常使以肿瘤细胞为靶标的筛选效果不是很理想，同时在反复洗涤过程中高亲和力噬菌体的流失、背景值高等问题也给噬菌体的生物淘洗带来困难。2001年Giordano等＼[14＼]在噬菌体展示技术的基础上创立了体外快速差减筛选技术（BRASIL），他通过差减筛选以降低非特异性结合，以经有机相单次离心技术来代替反复洗涤过程，减少高亲和力噬菌体的流失，从而为噬菌体展示技术筛选细胞表面分子结合肽提供更加优异的方法。

本文以中国仓鼠卵巢细胞株CHO为吸附细胞，卵巢癌细胞株HO-8910为靶细胞， 经过5轮生物淘洗，回收率从2.5×10-6增加至2.3×10-4，第五轮相对于第一轮回收率增加92倍之多，此结果为阳性噬菌体富集而造成。提示阳性噬菌体得到有效的富集。而后从第五轮淘洗后的噬菌体平板中随机挑选13个噬菌体克隆进行DNA测序，从而推断出外源多肽氨基酸的结构序列。本文结果显示，13个噬菌体包含7种多肽序列，其中噬菌体NPMIRRQ得到富集。由于肿瘤细胞表面存在复杂多样的生物活性分子，而噬菌体肽库的随机多样性为1.28×109，理论上筛选出噬菌体克隆也可能出现多样性，但本研究采用体外快速差减筛选技术，并优化筛选条件，如采用封闭液除去细胞表面非特异性结合，以CHO为吸附细胞，除去部分能与CHO细胞表面结合的噬菌体，而后再与卵巢癌细胞株HO-8910共同孵育，提高筛选的阳性率，因此可以解释以HO-8910细胞为靶标只筛选到1个高亲和性的阳性噬菌体NPMIRRQ＼[15，16＼]。

为进一步对筛选所得的这7种噬菌体对细胞株HO-8910的亲和性，本研究使用ELISA以及竞争性结合两种实验方法进行检测。在竞争性结合实验中，将M13K07作为对照组，研究阳性噬菌体与HO-8910细胞的结合率，优点在于排除了噬菌体数目、数量等众多影响因素。在之后的离心、复苏、测量滴度等方面可重复研究，无明显误差。且由于M13K07噬菌体无lac-Z基因，在平板上呈白斑，而其余研究的噬菌体呈蓝斑，故将白斑与蓝斑的比值作为不同噬菌体与HO-8910细胞的相对结合率。研究结果发现，7种噬菌体与HO-8910结合率均高出对照组约3～40.3倍之间，其中展示Asn-Pro-Met-Ile-Arg-Arg-Gln（NPMIRRQ）肽的噬菌体与HO-8910的相对结合效率是对照噬菌体的40.3倍。在ELISA 实验中，P/N（OD 随机克隆/OD阴性对照克隆）>2.1 时，就表示此克隆与细胞具有高亲和力，在本实验中，噬菌体NPMIRRQ的P/N>6，说明噬菌体NPMIRRQ与卵巢癌细胞株HO-8910有高亲和力，而其余6种噬菌体的P/N<2，提示与卵巢癌细胞株HO-8910亲和力不高。综合噬菌体竞争结合实验及ELISA实验结果显示，噬菌体NPMIRRQ与HO-8910细胞有较高的亲和性。

随后，我们利用细胞免疫染色、细胞免疫荧光、合成多肽的竞争抑制实验鉴定噬菌体NPMIRRQ与卵巢癌细胞株HO-8910的特异性。细胞免疫染色和细胞免疫荧光实验结果提示，噬菌体NPMIRRQ能特异性与HO-8910细胞表面结合，与其他肿瘤细胞（如Hela，PANC-1）不结合，而对照噬菌体M13K07则均不能与这三种肿瘤细胞表面结合。合成多肽的竞争抑制实验结果提示，多肽NPMIRRQ能抑制噬菌体NPMIRRQ与HO-8910细胞的结合，且呈剂量效应关系，而含相同氨基酸但不同组成顺序的对照肽PMIRRQN则不能抑制噬菌体NPMIRRQ与卵巢癌细胞株HO-8910的结合，进一步证实多肽NPMIRRQ对HO-8910细胞的特异性选择。综合细胞免疫染色、细胞免疫荧光、合成多肽的竞争抑制实验等结果，通过不同肿瘤细胞与靶细胞HO-8910之间对比，证实噬菌体NPMIRRQ能选择性与HO-8910细胞结合，同时可以推导出噬菌体NPMIRRQ能与HO-8910细胞结合是由展示在噬菌体表面的多肽NPMIRRQ介导的。

本研究采用噬菌体展示技术，使用差减筛选得到与HO-8910卵巢癌细胞株表面特异性结合的多肽NPMIRRQ，通过各种鉴定实验验证其亲和性及特异性，均提示此多肽能特异性与细胞株HO-8910结合，其可能为卵巢癌的早期诊断、转移复发监测、治疗提供新思路。

（致谢：本实验得到了温州医科大学生物教学实验中心、分子生物学实验中心的大力协助，谨致谢忱）

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（收稿日期：2015-04-02）