万斯斯，杨琪，钟晨，罗宇燕，张永明

(1.中山大学附属第三医院 药剂科，广东 广州 510630； 2.中山大学 药学院，广东 广州 510006)



SPG膜乳化法制备载BSA的PLGA微球的工艺考察

万斯斯1，杨琪1，钟晨2，罗宇燕1，张永明1

(1.中山大学附属第三医院 药剂科，广东 广州 510630； 2.中山大学 药学院，广东 广州 510006)

目的 采用SPG膜乳化法，制备载蛋白药物的聚乳酸聚乙醇酸(PLGA)微球，并对其形态学性质、载药量、体外释药进行考察。方法 以血清白蛋白(BSA)为模型药物，PLGA作为载体材料，采用SPG膜乳化技术结合复乳溶剂挥发法制备微球；分别考察初乳匀浆转速、内水相体积、膜挤出压力、外/内水相加盐等因素对微球质量的影响。结果 以优化处方制备的载药微球形态圆整、粒径均一，平均粒径为(55.51±0.24)μm，载药量、包封率分别为7.70%和69.33%，缓释时间达到40 d。结论 本研究获得了SPG膜乳化法制备BSA-PLGA缓释微球的新工艺。

SPG膜乳化法； PLGA； 缓释微球

近年来，随着生物科技的迅猛发展，越来越多疗效显著的蛋白、多肽类药物被开发上市。由于这类药物稳定性差、口服易降解，冻干粉针类制剂仍是其传统剂型，但难以解决半衰期短，需频繁、长时间注射给药的缺点，导致临床应用受到限制。利用生物可降解的新型聚合物材料为载体材料[1]，将蛋白多肽类药物制成微球注射剂，可达到体内持久缓释，减少给药次数，显著增加患者用药顺应性的目的。聚乳酸聚乙醇酸(PLGA)以良好的生物相容性受到很多学者的关注，已有多种以PLGA为载体的缓控释药物上市。

SPG膜(shirasu porous glass membrane)是日本SPG公司开发的新型无机膜，膜孔径微小均匀且可控[2]，原理是分散相在N2压力的作用下透过微孔膜的膜孔而在膜表面形成液滴，在沿膜表面不断搅拌的外水相溶液的冲洗作用下，液滴的直径达到临界值后，就从膜表面剥离，从而形成乳液，再结合溶剂挥发法固化后即可得到粒径均一可控的微球。本课题组采用SPG膜乳化法，以生物可降解的新型共聚物材料PLGA为载体材料制备BSA微球，达到缓释40 d的效果。前期研究考察了内、外水相体积对微球内外形态、药物分布和释放的影响[3]，本文以包封率、载药量、突释率、体外释药行为等为评价指标，进一步考察初乳匀浆转速、内水相体积、膜挤出压力、外/内水相加盐等因素对微球质量的影响，为SPG膜乳化法应用于蛋白类药物缓释微球的研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

MG-20外压式SPG膜乳化器(日本SPG公司)；T25高速匀浆器(美国IKA公司)；JSM-6330F冷场扫描电镜(日本电子公司)；RW16电动搅拌器(美国IKA公司)；SL16/40(R)冷冻离心机(美国Thermo 公司)；Precisa 92SM-202A电子天平(瑞士Precisa公司)；SHZ-82B恒温水浴振荡器(江苏正基仪器有限公司)；TGL-18C台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药

牛血清白蛋白(BSA，美国Genview公司)；聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA，美国伯明翰公司)；聚乙烯醇124(PVA，上海展云化工有限公司)；二氯甲烷(DCM,天津市富宇精细化学品有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)。

2 方法

2.1 微球的制备

称取适量BSA粉末，加入适量F68溶液充分溶解作为内水相。再与一定浓度PLGA的DCM溶液混合后，在冰浴条件下高速匀浆制成初乳。再将初乳作为分散相转移至SPG膜乳化器的储油罐内，通过N2加压的作用下透过SPG膜的膜孔，进入不断搅拌的PVA外水相溶液中从而形成复乳。低温条件下低速搅拌3 h使微球固化完全，离心收集，纯化水洗涤3次后冷冻干燥，即得。

2.2 微球载药量和包封率的测定[4]

精密称取载药微球约10 mg至7 mL离心管，加入0.1 mol/L NaOH-2%SDS溶液5.0 mL。置于37 ℃水浴箱内恒速振荡48 h使微球完全裂解，13 000 r/min离心 5 min 后，取上清液进行BCA法蛋白含量测定。同法处理空白微球的裂解液作为背景校正。按公式“载药量=微球中含药量/微球的总质量×100%”和“包封率=实际载药量/理论载药量×100%”分别计算微球的载药量和包封率。

2.3 微球的体外释放[4]

精密称取微球50 mg，加入10 mmol/L pH 7.4缓冲液1.5 mL，置于(37±5) ℃恒温水浴摇床中，以100 r/min匀速振荡，分别于5、12 h和1、2、4、7、10、15、20、25、30、35、40 d取出，13 000 r/min离心5 min，将上清液全部取出，加入新鲜的PBS。用BCA法测定上清液蛋白含量，同法处理空白微球作为空白对照，计算不同时间点蛋白释放量。

2.4 微球的形态特征

2.4.1 微球形态、粒径大小 使用马尔文激光粒度仪测定微球的粒径分布及平均粒径。本试验采用干法测量，干法进样器为Scirocco2000A，遮光度为0.5-6，测量时间为8～10 s，分散气压为3.5×105Pa。

2.4.2 微球的形态观察 将冷冻干燥后的微球均匀分散在贴有导电胶的载样台，置于真空条件下，喷上金粉。利用冷场扫描电子显微镜在电子束强度为10 kV的条件下观察微球表面及内部形态。

3 结果

3.1 SPG膜乳化法制备微球的处方考察

3.1.1 初乳匀浆转速对微球质量的影响 初乳的稳定性是SPG膜乳化法中影响微球理化性质最重要的因素之一。初乳制备过程中，匀浆转速会显著影响初乳的稳定性。本文在预试验的基础上，固定其他各参数，其中聚合物质量分数为15%、膜孔径为5 μm、挤出压力为30 kPa，分别考察初乳匀浆转速为5 000、10 000、15 000、20 000 r/min对微球质量的影响，结果见表1。可见，随着初乳匀浆转速加快，载药量、包封率显著增大，突释率逐渐降低。当转速升至15 000 r/min和20 000 r/min时，包封率增至67.91%和71.61%，突释率降低至39.23%和31.75%。进一步考察该因素对微球的体外释药行为的影响，分别测定不同时间的释药量，以时间为横坐标、累积释放率为纵坐标绘制曲线(图1)。结果可见，15 000 r/min在1 d内的累积突释率(39.23%)虽然大于20 000 r/min(31.57%)，但后者在40 d累积释放率仅为54.07%，而前者40 d累积释放超过75%，并且2～40 d范围内以均匀的速度释放药物，缓释时间较长。综合以上结果，选择最适初乳搅拌速度为15 000 r/min。

表1 初乳匀浆转速对微球质量的影响

初乳匀浆转速/(r·min-1)载药量/%包封率/%突释率/%50004.92±1.0344.3165.26±3.42100006.26±0.9256.3853.13±1.57150007.55±0.4067.9139.23±0.92200007.96±0.7171.6131.57±1.35

图1 初乳匀浆速度对微球体外释放的影响

Figure 1 The effect of rotational speed on the release from microspheres (n=3)

3.1.2 不同内水相体积对微球质量的影响 固定油相体积为4 mL，初乳搅拌速度为15 000 r/min，膜孔径为5 μm，挤出压力为30 kPa，分别考察内水相体积为150、300、600 μL对微球质量的影响，结果见表2。可见，当内水相体积由150 μL增加至300 μL时,微球的载药量、包封率增大,但继续增加至600 μL时，包封率反而下降，突释率随着内水相体积的增加而逐渐增大。从图2的体外释放行为可见，内水相体积为150 μL时，突释率虽低，但40 d累积释放量不到50%；比较内水相体积为300 μL和600 μL的微球，40 d累积释放量相差不大，但前者突释率明显低于后者。综合以上结果，选择内水相体积为300 μL。

3.1.3 不同膜挤出压力对微球质量的影响 固定其他参数，采用膜孔径为5 μm的SPG膜，分别考察挤出压力为40、30、20 kPa，记录相应挤出时间，并比较微球的质量，结果见表3。可见，随着挤出压力减小，所需挤出时间明显增加，当挤出压力减小至20 kPa时，载药量和包封率降低，突释率显著增加至62.77%。从体外释放曲线(图3)可见，挤出压力对40 d累积释放曲线影响不大，对突释有显著影响。挤出压力在30 kPa下微球的载药量、包封率高、突释率最低，微球形态圆整、粒径均一。综合以上结果，选择最适挤出压力为30 kPa。

表2 内水相体积对微球的影响

内水相体积/L载药量/%包封率/%突释率/%1505.91±1.6553.2228.52±2.093007.22±0.1465.0036.15±1.476005.62±1.1250.6051.57±2.42

图2 内水相体积对微球体外释放的影响

Figure 2 The effect of internal water phase volume on the release from microspheres (n=3)

表3 挤出压力对微球的影响

挤出压力及时间载药量/%包封率/%突释率/%40kPa/2min7.57±1.0268.1842.93±3.6730kPa/8min7.47±0.2567.2638.13±0.5820kPa/20min6.35±1.1657.1662.77±0.66

3.1.4 外水相或内水相加盐(NaCl)对微球质量的影响 考察在外/内水相均不加盐以及分别加盐3个处方对微球质量的影响，结果见表4。可见，在外水相中加入盐，显著增加微球包封率(80.32%)，降低突释率(29.02%)。但从释放曲线(图4)看，后期释放减缓，40 d的累积释放率减少；而在内水相中加入盐，不但载药量、包封率明显降低，突释率增加至76.38%，且5～40 d微球几乎不释放。综合以上结果，选择不加盐作为优化处方。

图3 挤出压力对微球体外释放的影响

Figure 3 The effect of extrusion pressure on the release from microspheres (n=3)

表4 外水相或内水相加盐对微球的影响

方式载药量/%包封率/%突释率/%内外水相均不加盐7.39±0.5766.5038.49±1.91外水相加盐8.92±0.9580.3229.02±0.38内水相加盐4.33±1.1238.9976.38±1.99

图4 外水相或内水相加盐对微球体外释放的影响

Figure 4 The effects of adding NaCl into external or internal water phase on the release from microspheres (n=3)

3.2 处方验证的结果

根据以上因素考察结果，确定处方工艺为：BSA 75 mg，F68溶液300 μL，PEG-PLGA 600 mg，二氯甲烷4 mL，初乳匀浆转速15 000 r/min，膜挤出压力30 kPa。以此处方制备3批微球，并对其形态学性质、载药量、体外释药进行考察，结果见表5。可见，3批微球的平均载药量为7.70%，包封率为69.33%，平均突释率为36.88%。体外释放行为(图5)显示，40 d累积释放率接近80%，整个释放周期以较均匀的速度持续释放。微球形态光滑圆整、粒径均一且分散性良好，平均粒径为(55.51±0.24)μm，见图6和图7。

表5 优化处方制备的微球的性质考察结果

批号载药量/%包封率/%突释率/%201503017.69±0.1569.1936.84±2.12201503027.67±0.1469.0438.30±3.35201503037.75±0.3669.7635.52±1.82

图5 优化处方制备的微球的体外释放曲线

Figure 5Invitrorelease of microspheres prepared by modified prescription (n=3)

图6 优化处方制备的微球的粒径分布

Figure 6 Diameter distribution pictures of microspheres prepared by modified prescription

a.1 100×; b.70×。

图7 优化处方制备的微球SEM图

Figure 7 SEM pictures of microspheres prepared by modified prescription

4 讨论

本文采用新型SPG膜乳化技术结合复乳溶剂挥发法制备BSA/PLGA缓释微球，与传统的机械搅拌、超声乳化法等比较，膜乳化法操作条件温和、能耗低，制备得到的微球具有粒径可控、尺寸均一、包封率高、重现性好等优点[5]；与复乳法[6]相比，该制备方法简单快速。结合预试验和前期研究[3]，本文选取初乳匀浆转速、内水相体积、膜挤出压力、外水相或内水相加盐4个因素，分别考察它们对微球质量的影响[7]。

初乳匀浆转速和内水相体积这两个因素是通过改变初乳的性质而影响微球质量的[8]。本文结果显示，随着初乳匀浆转速的增加，载药量和包封率增加，突释率降低。这可能是因为随着初乳的匀浆转速增加,初乳中内水相被剪切形成数目更多、体积更小的液滴，形成更加均质的体系，初乳的稳定性增加，从而形成的复乳体系中油相就含有更多更小的内水相液滴,使得包封率增加、突释率降低。

本文结果亦显示，随着内水相增加，载药量和包封率呈现先增加后减小，突释率呈现先减小后增大的现象。分析原因是内水相的体积小(150 μL),在投药量一定的情况下,溶解药物后内水相的黏度高,在制备初乳时越不容易分散,因此形成的微球内部孔洞数目少且孔径大[9]，导致包封率降低，突释增高；随着内水相体积增加(300 μL)，黏度降低、分散相改善，初乳的稳定性也就越高；但当内水相体积增加过大(600 μL)，微球内部的小液滴大量增加,意味着小液滴扩散到微球表面进入外水相的几率变大,引起药物损失,包封率再次降低。

挤出压力是SPG膜乳化法中影响微球理化性质另一个重要因素[10]，压力过大会使初乳以喷射状分散到连续相，来不及充分接触乳化剂，造成液滴直径变大，CV(coefficient of variation，变异系数)值也随之增加。若压力过低，不但膜通量减少，而且由于乳化速度变慢，乳化时间延长，造成初乳不稳定，降低包封率。本文通过调整不同挤出压力，最终确定膜孔径为5 μm的最适挤出压力为30 kPa。

为解决微球突释问题，通过在外水相中加入盐来升高渗透压，减少在固化过程中由于压差导致内水相中的蛋白扩散至外水相所引起的包封率下降、突释率增加[11-12]。本文结果显示，在外水相中加入盐，的确能显著增加包封率、降低药物突释，但同时由于微球近表面的水通道减少，内部的蛋白更加难以扩散释放，加剧后期释药不完全；而在内水相中加入盐，由于升高内水相的渗透压，导致微球表面孔洞剧增，突释异常严重，后续试验可以尝试调整盐量来改善突释。

本文采用SPG膜乳化法制备BSA/PLGA微球，初步筛选出优化处方，制备得到的3批微球粒径均一、形态圆整、分散性和流动性良好，载药量、包封率较高，体外释药平缓，说明该方法重现性良好，具有广泛的应用前景。试验中只是分别对4个处方工艺参数进行单因素考察，今后将进行多因素考察，以进一步优选工艺处方。

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(责任编辑：陈翔)

Preparation of BSA-loaded PLGA microspheres with SPG membrane emulsification

WAN Sisi1,YANG Qi1,ZHONG Chen2,LUO Yuyan1,ZHANG Yongming1

(1.DepartmentofPharmacy,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China; 2.SchoolofPharmaceuticalSciences，SunYat-senUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective To prepare poly (lactic acid) (PLGA) microspheres by SPG membrane emulsification method and investigate their morphological properties,drug loading and drug releaseinvitro. Methods Microspheres were prepared with serum albumin (BSA) as a model drug and PLGA as the carrier material by SPG membrane emulsification technique combined to double emulsion solvent evaporation method. The influence of rotational speed of colostrum homogenate,internal phase volume,adding salts into external or internal water phase,extrusion pressure and other factors on the quality of the microspheres were investigated. Results The morphology of microspheres with optimization prescription were round with uniform size,and the average particle size was (55.51±0.24) μm. Drug loading and encapsulation ratios were 7.70% and 69.33%,respectively. The release time was 40 days. Conclusion This study provided a new technology of preparing BSA-PLGA sustained-release microspheres by SPG membrane emulsification method.

SPG membrane emulsification; PLGA; sustain-released microspheres

2016-06-27

广东省医学科研基金资助(B2014150)

万斯斯(1981—)，男，主管药师，电话：020-85252233，Email:sisi-wan@tom.com；通信作者：张永明(1965—)，男， 博士，主任药师，从事缓控释制剂研究，电话：020-85253112，Email：874477522@qq.com。

时间：2016-10-08 14:57

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161008.1457.005.html

R944

A

1006-8783(2016)05-0550-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016062704