陈艳琳,王颖芳

(广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006)



microRNA定量检测方法研究现状

陈艳琳,王颖芳

(广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006)

MicroRNA(miRNA)是一类由18～24 nt核酸构成的非编码内源性小分子RNA，主要参与真核生物的细胞分化、增殖与凋亡等转录后水平的基因表达调控。研究发现，miRNA与肿瘤、代谢调控、疾病发生及诊断等方面有密切的联系，因此准确且灵敏地进行miRNA的定量检测是深入研究miRNA功能的前提。目前，miRNA定量检测原理主要基于核酸杂交或扩增，包括Northern印迹、微阵列芯片、实时定量PCR、滚环扩增等。本文通过对传统miRNA检测方法、高灵敏度新型miRNA检测方法进行阐述与分析，为筛选合适的miRNA定量检测方法提供参考。

microRNA； 实时定量PCR； 滚环扩增； Northern印迹

在现代生物学、医学研究中，microRNA(miRNA)是真核生物体内必不可少的调节因子。多数成熟miRNA具有高保守性，其可通过与靶mRNA 3′末端非翻译区( untranslational region,UTR)完全或不完全碱基配对，使靶mRNA降解或抑制翻译，进而参与转录后水平的靶基因表达调控[1-2]。研究表明，在肿瘤的发生及发展过程中，miRNA可作为一种分子标志物对靶基因介导的信号转导通路进行调控[3-4]，这为miRNA作为新的生物标志因子用于癌症等重大疾病的早期诊断提供依据，也揭示了miRNA在评估疾病表达水平中的重要性。

成熟miRNA的表达具有时空特异性、组织特异性[5-6]，在生物体内能抑制靶mRNA转录、翻译等，所以在多种真核生物过程中发挥着重要作用，尤其在细胞发育、植物生长等调控表达尤为突出。随着对miRNA、siRNA等小分子RNA的大量深入研究，发现miRNA介导的基因沉默技术在治疗及诊断疾病中发挥着重大作用，研究者运用分子生物信息学分析技术证实miRNA及其靶mRNA的存在[7]，至今为止，挖掘出人类基因组中的miRNA已超过1 000种[8]。这使得miRNA定量检测成为研究miRNA结构及生物学功能的基础，但因成熟miRNA序列短小，没有poly(A)尾巴，在细胞内低表达，家族成员间序列特异性差等，使miRNA定量检测难度很大[9-10]。为解决这一难关，近年来建立了多种灵敏度高、特异性强、简便及高通量的方法，其中基于探针杂交不需要样本扩增和样本miRNA扩增是应用最广泛的两种方法。在这两种方法的基础上，建立多种DNA扩增技术如恒温滚环扩增技术、微阵列芯片、探针标记技术以及可克服检测通量极限等新方法[11]。本文主要对应用广泛、新型miRNA检测方法展开论述及分析，以期为研究者进行miRNA研究提供借鉴。

1 microRNA传统检测方法

1.1 Northern blotting印迹分析

印迹杂交技术(Northern blotting)是最早应用在miRNA定量检测的标准方法。该方法运用标记的DNA探针与硝酸纤维素膜上的miRNA进行互补杂交，通过显影检测目标条带[12-13]。Northern blotting印记分析常采用同位素、荧光或纳米金标记DNA,此过程操作娴熟，可探知被检测miRNA的分子大小、凸显其丰度，且对仪器要求简单，因此一直被用于miRNA检测。但该存在法操作费时费力、耗样量大、高通量检测准确度低等缺点。

锁核酸( locked nucleic acid，LNA)探针检测方法显著弥补了Northern blotting印迹法的缺陷。LNA是一种新的双环寡聚核苷酸类似物，通过呋喃环的2′-O和4′-C不同程度缩水形成亚甲基桥并连接成环状的N-构象结构，可任意掺入到DNA中，使磷酸盐骨架局部结构的稳定性增加，进而提高miRNA检测的敏感度和特异性。运用LNA对Northern 印迹杂交技术进行参数优化，已广泛应用在普通miRNA检测过程中[14]。

1.2 微阵列芯片

微阵列芯片(microarray)是miRNA高通量分析方法的一种，能实现定时定量检测多个miRNA样品，在miRNA表达差异谱分析中应用较广[15]。该方法将多个已知序列的探针与miRNA杂交的芯片固定在固相支持物上，根据杂交后检测到的信号强度及数据分析，从而构建特异miRNA的表达谱。高通量是微阵列芯片检测miRNA的最大优势，但常伴有假阳性结果，在基因芯片制作和检测费用、探针类型及特异性等方面还存在缺点[16]，常用于miRNA的初步筛选[17]，难以在普通实验室普及。

基于微球杂交的流式细胞检测方法(Bead-based hybridization technology)改善了微阵列芯片的不足，将新载入的微球看作传统微阵列芯片上的一个点，这一特性不仅有助于捕获待测靶miRNA，且能避免固态芯片中的交叉反应。尽管芯片技术能够实现高通量检测，但在发现新miRNA的技术支持上比较薄弱，还需进一步的改进。

1.3 实时荧光定量PCR法(qPCR)

实时荧光定量PCR是高灵敏检测低表达miRNA最常见的方法之一[10]，尤其针对样本miRNA表达量低、样本间基因差异小等情况。该方法是在PCR反应体系中加入特殊的荧光基团，经由荧光信号来实时定量观察PCR的全进程，再根据标准曲线进行未知模板的定量分析。实时定量PCR一方面可检测极微量的miRNA基因表达及预测新颖miRNA；另一方面荧光标记核酸化学和寡核苷酸探针杂交技术的发展，促使qPCR成为定量检测miRNA的得力手段。目前，利用qPCR技术定量检测miRNA的方法主要包括茎环RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)和poly(A)加尾RT-PCR方法。

1.3.1 RT-PCR

茎环RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)可利用茎环结构的引物对miRNA进行反转录，用3′末端所含的与miRNA反向互补的茎环引物进行miRNA片段的逆转录，新合成miRcDNA可用于实时定量PCR扩增。此茎环状结构引物对成熟的miRNA 3′端具有特异性，能够将短的miRNA扩展，并且具有通用的3′引物位点进行实时PCR。该技术也被认为是先形成一种空间阻碍以阻止对前体miRNA进行PCR引导，再利用实时PCR进行高特异性的定量检测miRNA的表达水平。因茎环法特异性好、不需要标记、能够检测出低丰度靶mRNA、引物设计过程简单及精确性高等优点，逐渐成为定性检测miRNA的优势方法。其缺点是实验材料及仪器较昂贵。

1.3.2 polyA聚合酶加尾法

成熟miRNA分子剪接修饰后序列短小，常规的RT-PCR技术无法实现miRNA的定量或半定量检测，通常采用poly(A)加尾法进行miRNA的检测。在poly(A)聚合酶的作用下，miRNA的3′端加上一段寡聚腺苷酸的尾巴，形成一个与mRNA相似的结构，再用5′端带有oligo(dT)的通用引物反转录生成miRcDNA[18]，用于下一步的实时PCR反应。该引物由两部分组成：一部分为poly(T)12VN(V=A，G，C；N=A，T，G，C)，另一部分为通用引物5′-GCGAGCACAGAATTAATAC GAC-3′。与RT-PCR法对比，polyA聚合酶加尾法能一次性进行所有miRNA的加尾反应，检测特异性及灵敏度都较高；但此方法操作繁琐，检测费用较高，且无法实现定量检测。

为了克服以上劣势，poly(U)加尾miRNA检测方法应运而生[19]。此方法是利用polyU聚合酶在miRNA 3′端添加U的尾巴，逆转录为miRcDNA，再用通用引物5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′实时定量PCR。与ployA聚合加尾相比，Poly U加尾法是前者方法的扩展和补充，具有更广泛的适用性，具有良好的特异性及灵敏性，此方法为miRNA的检测分析及分子机制研究提供了良好的应用前景。

2 microRNA检测新方法

2.1 纳米粒子(Nano String)读数技术

纳米粒子读数技术是利用等离子体共振成像(SPRI)技术[20]及表面聚合反应进行miRNA检测。首先用一个连接序列与待检测的miRNA特异性结合，将此复合物与单链LNA标记的捕获探针和纳米金标记的核酸信号探针(约30个碱基T组成)杂交，经由SPRI技术检测分析，获得读数。基于纳米材料良好导电性，能使电子在生物分子和电极表面自由移动的原理，纳米材料读数技术的miRNA电检测研究获得了理想的结果。

Yin[21]等将生物素标记的单链信号DNA与锁核酸固定在纳米金上，形成生物素标记探针，将电极上的发卡探针与miRNA特异性杂交，并把生物素探针和链霉亲和素标记辣根过氧化氢酶加入到体系中，然后进行酶学扩增信号的检测，建立了灵敏度极高的miR-21电化学检测miRNA法。Dong等[22]将带有耦合Hg2+的分子信标(MB)与作为荧光基团的Ag纳米簇(AgNCs)，在核酸内切酶的辅助下进行的扩增反应应用到miRNA的检测，不仅避免复杂的温度控制及标记，且大大提升miRNA检测限。随着对miRNA检测技术的深入探索，发现将光学检测与纳米粒子检测联用可使生物样品检测灵敏度和检测范围极大地提高。Alhasan等[23]研发出一种针对低表达量miRNA的Scanometric miRNA检测方法，其检测灵敏度及检测范围都较强。首先，以T4 RNA连接酶2为介导，将miRNA与通用DNA分子连接，与miRNA微阵列杂交后，利用通用球状核苷酸化的AuNPs捕获杂交的微阵列miRNA，再利用金沉积扩增、成像。

纳米粒子读数技术可实现miRNA检测的高灵敏度、高通量、高特异性等要求，无需序列扩增和逆转录,可实时检测。但纳米粒子易受外界溶液PH或离子强度的影响。此外，探针密度也会影响特异性杂交效率，因此在选择纳米技术检测miRNA时要尽量规避上述问题。

2.2 基于RCA检测方法

滚环扩增技术(rolling circle amplification，RCA)是一种恒温核酸扩增方法。设计的引物与环状DNA分子连接后，聚合酶将连续复制出无数个环的互补序列拷贝，这是与PCR差异之处。该方法可在短时间内使目标miRNA分子数量倍增，使检测信号放大，反应过程无需特殊仪器设备，可广泛地应用在RNA、DNA和蛋白质，尤其miRNA的定量检测分析[24]。

Jonstrup等[25]首次把RCA技术应用到miRNA检测上，该研究将miRNA做为连接模板与探针连成环，并作为引物在聚合酶的作用下引发RCA反应。一些研究者在此基础上，改进RCA扩增技术，使miRNA检测灵敏度及特异性大大提升。Cui等[26]建立滚环-循环酶双扩增法(RCA-CEAM)，即将RCA与CEAM(循环酶扩增)联用检测miRNA表达，使检测灵敏度大大地提高至12fm。Ge等[27]设计滚环扩增-荧光原位检测法(TPRCA-FISH),该方法是基于靶细胞引发的滚环扩增，以circular DNA为探针与靶miRNA结合，然后miRNA游离的3′末端发生RCA反应，进而扩增产物与荧光探针原位杂交。该方法产生的杂交信号很强，且易与背景信号区分，能够简便快速地检测低丰度表达的miRNA。Wen等[28]将RCA、切口酶信号扩增及DNA酶信号扩增结合起来，使miRNA定量检测水平提升至2 amol/L。Liu等[29]将锁探针-RCA与切口酶信号扩增技术联用，设计出P-ERCA法(padlock probe-based exponential RCA)，RCA扩增检测的效率进一步提高，使miRNA在高通量分析中更加精确。

尽管滚环扩增技术特异性强、检测范围广、可区分miRNA单碱基的差异，在构建miRNA高通量检测的微阵列上也有独特的优势，但该法扩增耗时长、工具酶价格昂贵、RCA模板合成难度大，故在miRNA定量检测的应用中并不常见。

2.3 基于酶信号放大的电化学检测

根据酶具有催化作用，可使单个杂交分子转变成大量的检测分子的特性，可将酶作为生物分析的标签，这一特性使基于酶的电化学检测越来越多的应用到miRNA检测中。Pohlmann等[30]设计了一种间断杂交检测miRNA的电化学方法，采用DNA/RNA杂交链及酯霉素-2-脱氧核苷酸(EST-2-ODN)作为化学检测标志物，进行miRNA的定量检测。此方法依据互补原则将miRNA与检测核苷酸固定在探针上，使用标记酶与之杂交。Lin等[31]将第三代E-DNA传感器应用到miRNA检测，其中具茎环结构DNA的热力学稳定性使背景信号降低，增强反应特异性，再使用生化酶进行电化学信号扩增。此方法在区分高保守性的miRNA家族成员上有极大优势。Deng等[32]将靶标miRNA与绑定在特殊磁珠上的探针(DZ-CPs)杂交，再使用特异性核酸酶切割，通过磁铁将未反应的DZ-CPs及磁珠去掉，以余下溶液中的DNA分子看作催化剂，在过氧化氢的存在下催化3,3′,5,5′-联苯胺，再采用比色法进行高灵敏度检测。

酶信号扩大检测miRNA虽满足了高灵敏度、高特异性等要求，但仍存在扩增模板序列设计不易成功、背景信号高等缺陷，故酶辅助miRNA的电化学检测法仍需大力改进。

2.4 测序法[33]

以上关于miRNA的检测均是用于单个且已知序列miRNA的测定，无法对未知序列的miRNA进行检测。新一代大规模测序、miRNA芯片、克隆和Nano String读数等可用于特定样品中的miRNA种类及特定miRNA的表达分析，但样品必须先进行扩增才能开展测序检测，然后根据miRNA的表达丰度定量分析。

2.4.1 克隆测序

克隆测序法是预测新miRNA最古老的方法之一，此方法要先抽提RNA，进行RT-PCR扩增，构建miRNA的cDNA文库，然后把扩增产物克隆到表达载体上深度测序。获得大批量的Raw data序列，与各数据库比对进行miRNA的定量检测，进而鉴定新miRNA。

为提高直接克隆的灵敏度，Takada 等[34]建立了新型扩增克隆法(miRNA amplification profiling，mRAP)，该法系将miRNA的3′端与接头相连，然后用与接头反向互补的引物反转录。因特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸转移酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸dC)会连接到反转录中的cDNA链的3′末端。当5′端接头与cDNA链的poly(C)粘性末端退火后，加入一对通用引物即可实现对cDNA的PCR扩增。mRAP灵敏度比较高，因此可直接用克隆和测序技术检测少量组织中miRNA 的表达量。Cummins等[35]在基因表达系列分析(SAGE)技术的基础上研发了检测效率较高的miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，即标签序列克隆。该法先要给miRNA分子连上特定的接头，以便用生物素标记的引物进行反转录，接头经过酶切后用链亲和素包被的磁性微球移除，然后按照优化了的SAGE法进行释放标签的串联、克隆和测序。

克隆测序法可直观可靠的检测miRNA表达，是检测未知miRNA序列最常用的方法之一，但对低表达量或组织及细胞特异性的miRNA较难检测，且耗样量大、操作繁琐等劣势，如今已逐渐被新的检测方法所取代。

2.4.2 新一代测序技术[36]

新一代测序技术始于1987年ABI公司推出的用于绘制人类基因组图谱的Sanger法。自2005年以来，新一代高通量测序技术取得突飞猛进的发展，目前，运用新一代测序技术可从转录组测序水平、small RNA测序水平、降解组测序水平等多角度进行功能差异基因表达、miRNA检测及遗传物质的全面分析，亦可从基因组水平、转录组水平、蛋白质水平等全方位解析分子生物学功能，是具远大发展前景的miRNA检测技术[37]。

新一代高通量测序技术首推罗氏公司的454焦磷酸测序技术、Il-lumina公司的Solexa基因组测序。这两者都能定性、定量检测miRNA的基因表达水平，不仅可检测已知miRNA长度和序列的微小改变，亦可检测出miRNA的表达丰度，也是挖掘新miRNA的重要工具。两种测序方法在测序原理、数据量及数据质量、成本方面虽有差异，但测序步骤基本相同，主要包括：样品的制备、模板准备、测序及成像、small RNA序列组装和比对等[38]。其中，454测序技术利用微乳滴PCR进行扩增，将连接得到的每一片段分别与微球结合，使微球在含有PCR反应体系的油滴中独立扩增。将微球中的双链DNA进行变性得到带有单链DNA的微珠，再加入到排列有微升级小孔的检测板中，对微球上片段进行基于焦磷酸盐的测序。而Solexa测序技术[39]的原理基于边合成边测序，使用桥式PCR来扩增，是唯一不采用传统聚合酶进行测序的方法，与前者最大的区别在于以4种不同荧光基团分别标记16种寡聚核苷酸片段，加入测序引物进行连接反应。

454测序技术因操作简单且一次测序可检测到200～300 nt长度序列的优势，在寻找新miRNA和转录组测序中占据着重要地位。但此法在进行miRNA定量检测时要依赖一系列的酶，增大了检测的假阳性。Solexa基因组分析仪在每次引物延伸过程中都会掺入一个碱基，导致基因错配的几率加大，但在50 bp读长范围内，Solexa测序仪的准确率高达99%以上，这一特性使之成为与qRT-PCR方法并驾齐驱的新颖miRNA检测方法。

2.5 Agilent 2100 Bioanalyzer[40]

Agilent 2100 Bioanalyzer技术是以生物芯片核酸分析系统(简称Bioanalyzer)为原理进行miRNA定量检测，采用高灵敏度的荧光检测系统可在一定程度上克服琼脂糖凝胶电泳的局限性和误差。

Agilent 2100 Bioanalyzer检测miRNA需先构建cDNA文库，通过特异性引物的介导，以cDNA为模板，进行PCR反应。按照DNA 7500 LabChip试剂盒所提供的说明制备凝胶染料及芯片，将PCR产物加入到芯片样品孔后，涡旋震荡放入Agilent 2100 Bioanalyzer中进行自动检测分析。该法在准确度、重复性上有独特的优势，如：①耗时短：在分离管道和高电场的应用下，30 min内就可完成若干个miRNA的连续自动化分析；②操作简便：与琼脂糖凝胶电泳不同，Agilent 2100 Bioanalyzer无需进行凝胶制备、跑电泳、染色、成像等，也不用进行繁琐的数据分析；③样品用量少：以微小样品消耗量进行检测，可实现miRNA的微量化；⑤安全高效：最大限度地减少危害物质的接触(如EB)，并减少废物量。鉴于以上优点，Agilent 2100 Bioanalyzer芯片分析系统和PCR特异性反应结合，在miRNA的检测和鉴定中具有巨大的发展前景。

表1 几种miRNA检测方法的特点及灵敏度Table 1 Characteristics and sensitivity of several miRNA detection methods

3 小结与展望

建立理想的miRNA定量检测分析方法，将有助于研究miRNA的高度保守性、时空特异性等生物学功能，使得miRNA为疾病诊断和生物医药制剂的研发带来新契机。目前，miRNA定量检测方法的建立主要依赖各种探针设计和标记技术，与微阵列芯片、实时荧光定量PCR、高通量测序等技术联用来提高检测灵敏度和特异性。随着Q-PCR分析服务的可靠和直观性，越来越多的研究者选用此法进行miRNA表达水平的验证分析，同时，新一代测序技术成本不断降低，运用测序分析仪进行miRNA高通量建库检测技术迅速发展，近年建立起以调控基因表达的靶mRNA或以miRNA为检测疾病的构想，已成为未来研发的热点。与传统的miRNA检测方法相比，新一代测序技术、RCA等检测方法凭借高通量、高质量、高准确度、可重复性等优势，普遍应用于新 miRNA预测、筛选差异表达功能基因、miRNA靶基因的预测及miRNA异构体检测等方面。但每种方法也有不可忽略的缺陷，故往往要根据实验目的及检测方法的优劣势或多种方法联用以选择合适的miRNA检测方法。相信随着转录组测序、small RNA测序、降解组测序及蛋白基因组学等技术的发展，大规模的miRNA定量检测技术将会更广泛地应用在分子生物学研究中。

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(责任编辑：王昌栋)

Current research in methods for the quantitative detection of microRNA

CHEN Yanlin,WANG Yingfang

(SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

MicroRNA(miRNA) is a kind of non-coding endogenous small molecule RNA,which is composed of 18-24 nt nucleic acid. It is mainly involved in the regulation of cell differentiation,proliferation and apoptosis. Mature miRNA sequence is short,highly conservative,stability and other characteristics,which increases a lot of difficulties for accurate detection of miRNA levels. miRNA quantitative detection principle is mainly based on nucleic acid hybridization or amplification,including Northern bloting,microarray chip,real-time quantitative PCR,rolling ring amplification,etc. Through the analysis of the advantages and disadvantages of the existing miRNA detection technology in recent years,this paper will provide a reference for screening suitable miRNA quantitative detection method.

microRNA; quantitative PCR; rolling ring amplification; Northern bloting

2016-08-24

国家自然科学基金青年基金项目(81403195);广东省自然科学基金项目(S2013010015418)

陈艳琳(1991—),女,2014级硕士研究生,Email:944589543@qq.com；通信作者：王颖芳(1975—),女,副教授,从事中药方剂学研究，Email:150306757@qq.com。

时间：2016-10-08 11:45

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161008.1145.003.html

Q522

A

1006-8783(2016)05-0666-06

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016082402