吕小辉，孙佳瑜，蔡智刚，张瑞鹏，单爱云

(1.深圳市福田区中医院，广东 广东 518033； 2.深圳清华大学 研究院，广东 广州 518067)



六味地黄丸含药血清对Eahy926细胞ERK/Nrf2-HO-1信号通路的影响

吕小辉1，孙佳瑜1，蔡智刚1，张瑞鹏2，单爱云1

(1.深圳市福田区中医院，广东 广东 518033； 2.深圳清华大学 研究院，广东 广州 518067)

目的 观察六味地黄丸含药血清对人血管内皮细胞Eahy926增殖及其ERK/Nrf2-HO-1信号通路的影响。方法 CCK-8检测大鼠5%、10%、20%空白血清与5%、10%、20%含药血清对Eahy926细胞增殖的影响，并用Western-blotting方法检测10%含药血清对Eahy926细胞ERK/Nrf2-HO-1信号通路分子蛋白表达的影响。结果 六味地黄丸含药血清可以促进Eahy926细胞的增殖；在Eahy926细胞中，10%六味地黄丸含药血清能够促进ERK的磷酸化、Nrf2核转位和HO-1蛋白的表达，明显高于无大鼠血清组和10%空白血清组。结论 10%六味地黄丸含药血清诱导ERK磷酸化介导Nrf2入核和HO-1蛋白的表达。

六味地黄丸； 血管内皮细胞； ERK/Nrf2-HO-1； 蛋白表达

血红素加氧酶(HO)是哺乳动物内源性保护酶，是体内血红素代谢的起始酶和限速酶，主要将血红素代谢成胆绿素、一氧化碳和游离的铁离子。HO在体内有HO-1、HO-1、HO-3 3种同工酶，其中HO-1为可诱导型HO，参与体内众多抗氧化事件。血红素加氧酶-1(HO-1)表达需要其核转录因子Nrf2激活后入核与相应的启动子结合，Nrf2的激活与ERK的磷酸化有着密切关系，磷酸化的ERK可以促进Nrf2激活，与封闭蛋白解离入核，进而促进HO-1蛋白的表达。以往研究发现六味地黄丸含药血清[1]和激活ERK/Nrf2-HO-1信号通路[2]都具有血管内皮保护作用，推测六味地黄丸含药血清可能具有激活ERK/Nrf2-HO-1信号通路的作用。本研究主要观察六味地黄丸含药血清在血管内皮细胞上对ERK/Nrf2信号通路是否有调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠20只，体质量180～220 g，广州医学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002。

1.1.2 药物 六味地黄丸购于北京同仁堂，批号20150415，取六味地黄丸100丸(每8丸相当于生药材量3 g)，机械粉碎成粗粉，加入50 mL蒸馏水混匀，浓缩至1.56 kg/L的药液。

1.1.3 主要试剂 DMEM培养基(Hyclone)；胎牛血清(PAN)；0.25%胰酶(Hyclone)；BCA蛋白定量试剂盒和CCK-8试剂盒(碧云天科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(Solarbio)；ERK和p-ERK一抗(SatanCruz)；Nrf2和HO-1一抗(abcam)；β-actin和所有的二抗(中杉金桥)；U0126(CST)。

1.1.4 主要仪器 Forma-371型CO2培养箱(Thermo)；5418R型低温冷冻离心机(Effendorf)；EN12469型超净工作台(ESCO)； A2LED型倒置显微镜(Zeiss)；elx-808型全自动酶标仪(Biotek)。

1.2 方法

1.2.1 含药血清制备 将SD大鼠随机分为空白组和六味地黄丸给药组，每组各10只，通过预实验确定给药组生药浓度为1.56 kg/L六味地黄丸混悬液，10 mL/kg灌胃，每天1次，空白组给予同体积生理盐水灌胃，连续给药3 d，第4天给药后2 h心脏取血，4 ℃冰箱过夜，5 000 r/min离心5 min分离血清，56 ℃水浴30 min灭活补体，超滤灭菌，-80 ℃保存备用。

1.2.2 Eahy926细胞培养 人血管内皮细胞株Eahy926，在含10%(φ)胎牛血清的DMEM培养基，5%(φ)CO2、37 ℃恒温条件下培养。

1.2.3 含药血清对Eahy926细胞增殖的影响 细胞生长融合度80%以上，消化细胞成单细胞悬液，以5×107cells/mL单细胞悬液100 μL接种于96孔板中，当细胞生长融合度达80%时，使用基础培养基同步化24 h，将细胞分为无大鼠血清组、正常大鼠血清(NS)组(5%、10%、20%)和给药大鼠血清(MS)组(5%、10%、20%)每组设6个复孔，培养48 h后，加入CCK-8试剂37 ℃培养箱孵育2 h后，用酶标仪在490 nm波长下检测每孔细胞吸光度值(A值)。

1.2.4 细胞蛋白提取和Western blotting检测[3]用预冷的PBS清洗培养皿3次，用预冷的RIPA蛋白裂解液刮取细胞，冰上裂解15 min后，14 000 r/min离心15 min，取上清。从上清中取少量按照BCA蛋白定量试剂盒定量后，用上样缓冲液将所有样品调制相同浓度，混匀100 ℃变性5 min，分装冻存。蛋白上样20 μL，垂直电泳跑胶，积层胶电压为80 V，分离胶电压为110 V，湿转转膜至NC膜上，脱脂奶粉封闭，一抗过夜，洗膜后二抗孵育，加显影液凝胶成像曝光。

1.2.5 含药血清对HO-1表达的作用 将细胞铺于直径60 mm的平皿中，分为无大鼠血清组、正常大鼠血清组[U1]和给药大鼠血清组，正常大鼠血清组和给药大鼠血清组分别用10%的正常大鼠血清和10%给药大鼠血清孵育细胞48 h，提取细胞蛋白，用Western blot检测HO-1蛋白的表达。

1.2.6 含药血清对Nrf2转位的作用 将细胞铺于直径60 mm的平皿中，分为无大鼠血清组、正常大鼠血清组和给药大鼠血清组，正常大鼠血清组和给药大鼠血清组分别用10%的正常大鼠血清和10%含药大鼠血清孵育细胞48 h，提取细胞核蛋白，用Western blot检测Nrf2蛋白的表达。

2 结果

2.1 CCK-8检测不同浓度的含药血清对Eahy926细胞增殖的影响

表1结果提示，与无大鼠血清组比较，3个浓度给药大鼠血清组和10%、20%的正常大鼠血清组吸光度值明显增高(P<0.05)；这说明给药大鼠血清和10%、20%的正常大鼠血清能够促进细胞的增殖；10%、20%的无大鼠血清组与同浓度的给药大鼠血清组比较吸光度值差异无统计学意义，5%给药大鼠血清组与5%正常大鼠血清组吸光度值比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 CCK-8法测定各组Eahy926细胞A值

组别正常大鼠血清给药大鼠血清无大鼠血清组0.54±0.120.55±0.145%血清组0.56±0.140.79±0.13*#10%血清组0.71±0.15*0.81±0.15*20%血清组0.83±0.16*0.83±0.17*

与无大鼠血清组比较：*P<0.05；与5%正常大鼠血清组比较：#P<0.05。

2.2 含药血清对HO-1表达的作用

实验结果提示，给药大鼠血清能够诱导HO-1蛋白的表达，并具有剂量依赖性，与无大鼠血清组比较差异有统计学意义(P<0.05)；10%正常大鼠血清对HO-1的表达没有作用，与无大鼠血清组比较差异无统计学意义(图1)。

Con10%NS5%MS10%MS20%MSHO-1β-actin3.53.02.52.01.51.00.50HO-1/β-actin*****Con10%5%10%20%NSMS

与无大鼠血清组比较：*P<0.05，**P<0.01。

图1 含药血清在Eahy926细胞上对HO-1表达的影响

2.3 含药血清对Nrf2转位的作用

实验结果提示，10%给药大鼠血清能够促进核转录因子Nrf2核转位，与无大鼠血清组比较差异有统计学意义(P<0.01)；10%正常大鼠血清对核转录因子Nrf2核转位没有作用，与无大鼠血清组比较差异无统计学意义(图2)。

2.4 含药血清诱导ERK磷酸化介导Nrf2核转位和HO-1表达的作用

如图3A所示，10%给药大鼠血清能够明显诱导ERK的磷酸化，与无大鼠血清组比较差异有统计学意义(P<0.01)，而10%正常大鼠血清不能诱导ERK的磷酸化，如图3B，3C所示加入ERK磷酸化特异抑制剂U0126后，U0126阻断了10%给药大鼠血清诱导Nrf2的核转位和HO-1的表达。以上结果提示，10%给药大鼠血清诱导ERK的磷酸化介导Nrf2核转位和HO-1表达。

**Con10%NS10%MSNrf2(Nucleus)β-actin3.53.02.52.01.51.00.50Nrf2/β-actinCon10%NS10%MS

与无大鼠血清组比较：**P<0.01。

图2 含药血清在Eahy926细胞上对Nrf2核转位的影响

3 讨论

血管内皮细胞是覆盖在血管内层的一层细胞，是循环血液与血管平滑肌的机械屏障，具有多种生理功能，参与机体的凝血、免疫、物质转运和生物活性物质释放等生命活性，血管内皮损伤是心血管疾病的病理基础，保护血管内皮细胞损伤，对减少心血管疾病意义重大。以往研究表明，HO-1对血管内皮细胞损伤具有保护作用，能够促进血管内皮细胞的增殖[4 ]，减少血管内皮细胞的凋亡[5]，对抗内皮细胞氧化应激[6]，修复内皮损伤[7]。HO-1表达与其转录因子Nrf2入核密切相关，对HO-1的表达发挥重要的作用，基础状态下Nrf2与Keap-1偶联在一起，以非活化的形态存在于细胞之中，在启动因素刺激下，Nrf2被激活与Keap-1解偶联，进入细胞核与ARE相互作用，启动HO-1基因转录，促进HO-1的表达。以往的研究显示，ERK信号通路的激活与Nrf2的活化入核有着密切的关系[8]，一些自然产物能够活化ERK促使Nrf2磷酸化入核，与核内相应启动子结合，增加HO-1的表达[9-10]。

**10%MS10%NSConp-ERKERK2.01.51.00.50P-ERK/ERKCon10%NS10%MS+-+-++--0.70.60.50.40.30.20.10HO-1/β-actinMS(10%)U0126HO-1β-actin**##Con10%MS10%MS+U0126U0126AC**##MS(10%)U0126Nrf2β-actin+-+-++--1.41.21.00.80.60.40.20Nrf2/β-actinCon10%MS10%MS+U0126U0126B

A. 10%给药大鼠血清对ERK磷酸化的作用(与无大鼠血清组比较：**P<0.01)； B. ERK磷酸化抑制剂U0126阻断10%给药大鼠血清促进Nrf2表达的作用(与无大鼠血清组比较：**P<0.01; 与U0126组比较:##P<0.01); C. ERK磷酸化抑制剂U0126阻断10%给药大鼠血清促进HO-1表达的作用(与无大鼠血清组比较：**P<0.01; 与10%给药大鼠血清组比较：##P<0.01)。

图3 含药血清在Eahy926细胞上诱导ERK磷酸化介导Nrf2入核和HO-1蛋白

六味地黄丸组方源于宋代医学家钱乙的《小儿药证直决》是滋补肾阴的基础方剂配伍组方上具有“三补三泻”的特点，主要由熟地、泽泻、山萸肉、丹皮、山药、茯苓六味中药组成，具有滋阴益肾的作用，现代医学研究发现六味地黄丸具有抗癌、增加细胞免疫性、调节血压血脂[11]、降低血糖、血脂、抗氧化等作用[12]，而六味地黄丸含药血清对HO-1表达及上游ERK/Nrf2信号通路的研究报道很少。本实验研究发现5%六味地黄丸的给药血清能够对血管内皮细胞Eahy926增殖有促进作用，与对照组和空白血清组比较差异有统计学意义，同时发现10%六味地黄丸含药血清能够促进ERK的磷酸化，并且使用ERK磷酸化的特异抑制剂U0126能够阻断ERK的磷酸化，同时也阻断10%六味地黄丸含药血清对HO-1的诱导表达和转录因子Nrf2的入核，结果提示，10%六味地黄丸含药血清诱导ERK磷酸化介导Nrf2入核和HO-1蛋白的表达。本文只是初步探讨了10%六味地黄丸含药血清对ERK/Nrf2-HO-1信号通路的调节作用，六味地黄丸含药血清是否通过ERK/Nrf2-HO-1信号通路对损伤血管内皮发挥保护作用，还需要进一步研究。

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(责任编辑：幸建华)

Effect of drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the ERK/Nrf2-HO-1 signaling pathway in Eahy926 cells

LYU Xiaohui1,SUN Jiayu1,CAI Zhigang1,ZHANG Ruipeng2,SHAN Aiyun1

(1.ShenzhenFutianDistrictTraditionalChineseMedicineHospital,Guangdong518033,China; 2.KeyLabforNewDrugsResearchofTCM,ShenzhenResearchInstituteofTsinghuaUniversity,Shenzhen518067,China)

Objective To investigate the effect of drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the ERK/Nrf2-HO-1 pathway in Eahy926 cells. Methods The proliferation of Eahy926 cells was detected by CCK-8 method. Western blotting was used to determine the protein expression of the ERK/Nrf2-HO-1 pathway. Results The drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills promoted the proliferation of Eahy926 cells. The levels of ERK phosphorylation,Nrf2 nuclear translocation and HO-1 expression in Eahy926 cells treated with 10% drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills were significantly higher than that of the control and blank groups. Conclusion 10% drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills promotes Nrf2 nuclear translocation and expression of HO-1 via inducing ERK phosphorylation.

Liuwei Dihuang pills; vascular endothelial cells; ERK/Nrf2-HO-1 signaling; protein expression

2016-05-10

深圳市科技研发基金(JCYJ20140414145007216)

吕小辉，女，主管药师，主要从事临床药学研究，Email:22181265@qq.com；通信作者：单爱云，女，主任药师，主要从事药事管理研究，Email:253010652@qq.com。

时间：2016-09-30 9:39

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.0939.001.html

R285.5

A

1006-8783(2016)05-0618-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016051001