庞惠文，乔凌云 译自 Journal of Poultry Science，Vol.53(2016)：173～180

俸艳萍 校 夏俊花 审 罗静如 制图

禽类受精过程中的精卵互作

庞惠文，乔凌云 译自 Journal of Poultry Science，Vol.53(2016)：173～180

俸艳萍 校 夏俊花 审 罗静如 制图

受精是有性生殖动物繁育下一代必不可少的过程。在过去数十年中，我们对哺乳动物精卵互作分子机制的理解已取得重要进展。然而，由于禽类的卵子较大和模拟发生在正常受精过程中的生理性多精受精过程有一定困难，我们在禽类精卵互作方面积累的知识并未达到类似于在哺乳动物上积累的水平。本文将总结目前人们对禽类受精过程中精卵互作机制的理解，尤其着重总结精卵结合、精子的顶体反应以及卵周膜通道形成所必需的真精子蛋白酶；解释卵周膜中透明带(Zona Pellucida，ZP)蛋白(ZP1和ZP3)在精卵结合、顶体反应诱导以及精子蛋白酶消化作用下的精子渗透作用。我们期望：对鸟类受精过程的更深刻理解，能够为家禽行业中包括生产转基因或克隆禽类在内的众多应用开发强有力工具开辟新的途径。

顶体反应；受精；卵周膜；精卵互作；精子蛋白酶

在任何有性生殖的动物中，受精是繁殖后代必不可少的过程。总体而言，受精是一个按时序逐步发生的重要生理过程，包括精卵物种特异性的结合、顶体反应的诱导、精子渗透进入卵子以及配子的融合。大量研究表明：透明带(包围在哺乳动物卵子周围的卵膜)在受精过程中精卵互作的第一步上起着重要作用。当精子接触到卵子时，它们必须先穿过透明带，然后才能进行精卵融合。尽管我们尚未完全理解受精过程中这些生理活动的分子机制，但研究人员从利用如转基因和基因敲除等反向遗传技术的研究中，已找到了哺乳动物中调控受精过程的大量证据和关键作用分子。

与哺乳动物相比，禽类的卵子特别大，这导致我们无法在体外通过直接观察禽类的精卵互作来研究这个过程。举例来说，至今还未有可行的禽类体外受精(in vitro Fertilization，IVF)方法，研究人员只好将分离的卵周膜(哺乳动物透明带的类似物)与采集的精子进行体外培养作为体外受精的替代模型。此外，由于系带层(也称为卵黄膜外层，由输卵管漏斗部分泌)会在排卵后会迅速覆盖在卵周膜表面，排出的卵子很快会失去受精能力。随后，精子将不再与这些卵子互作，而被阻留在系带层或卵清蛋白中。尽管存在这些困难，但包括我们实验室在内的多个研究小组使用家养禽类(主要是鸡和鹌鹑)研究了禽类受精的机制。

本文我们将总结人们对禽类受精过程中精卵互作机制的最新认识，特别是对精卵结合、精子顶体反应以及卵周膜孔形成所必需的真精子蛋白酶。

1 精卵结合

精卵结合是受精过程的第一步。1980年，Wassarman研究小组在小鼠上确定了3种透明带蛋白ZP1、ZP2和ZP3，并发现ZP3负责(小鼠)物种特异性的精卵结合。在此基础上，随后研究人员也在很多动物的卵膜中鉴定出了精卵结合所必需的ZP蛋白。尽管ZP蛋白的结构和功能在进化上比较保守，但有趣的是不同动物的ZP蛋白来源却不相同。例如，小鼠的3种ZP蛋白是在不断发育的卵细胞中合成，而兔的ZP3蛋白则产生于卵巢颗粒细胞。在一些卵生动物(例如鱼和鸟类)中，一些卵外膜蛋白由肝脏分泌，并经血液循环运输至卵巢；不过，在非洲爪蟾中，卵细胞则是ZP蛋白的唯一来源。

我们之前报道了鹌鹑的卵周膜至少由5种蛋白组成(ZP1、ZP2、ZP3、ZP4和ZPD)。正如前言中所提及的，禽类无体外受精系统，一般以离体卵周膜作为研究精卵互作机制的替代途径(图1)。利用这个系统，我们曾报道了纯化的鹌鹑ZP3蛋白的特异性抗血清在日本鹌鹑上能有效阻止精子穿透卵周膜。对于这一抑制现象，有3种可能的解释：(1)抗血清覆盖了ZP3蛋白(精子的一个结合位点)，从而阻止了精卵结合；(2) 抗血清阻止了精子的顶体反应；(3) 抗血清抑制了消化卵周膜的蛋白酶的作用。尽管我们没有进行进一步的试验，但Bausek等通过测试纯化的ZP1或ZP3蛋白与精子的结合，证明了两种ZP蛋白均能特异性地结合到精子头部的顶端。然而，在鸡上，仅ZP3蛋白能能够通过与分子量为180 kDa的精子蛋白产生互作而发生结合反应。这些结果表明ZP3蛋白是鸡和鹌鹑卵周膜上的精子结合蛋白，不过具体的精卵结合机制仍不清楚。在小鼠中，有报道称ZP2蛋白也有助于精子结合；ZP2蛋白被卵巢皮质颗粒蛋白酶的有限消化会产生结构性改变，这能防止多精受精。在禽类中，ZP2蛋白表达于未成熟卵泡的卵细胞中，并作为一种微量组分存在于卵周膜中。前不久，Nishio及其同事证明了鸡的ZP2蛋白在未成熟的卵细胞包被层中累积，并驻留在成熟卵子的胚盘区。尽管ZP2蛋白与精子的结合特性尚未进行测试，但研究鸡中报道的ZP2蛋白位置是否与精子穿透卵子更多地发生在胚盘区的这种现象相关将会十分令人关注。要证明禽类中的精卵结合分子机制还需进一步的研究。

正如前文所述，ZP蛋白在精卵结合过程中起着重要作用。然而，禽类中负责精卵互作的辅助分子，包括在精子表面与ZP蛋白互作的活性组分仍有待研究。为此，我们制备了抗鹌鹑精细胞膜组分的单克隆抗体(Monoclonal Antibody，MAB)库，并在体外通过精子检测了MAB库(成员)抑制卵周膜孔形成的能力。在MAB库的上浮物中，我们发现上浮物19A16A13能强有力地阻止卵周膜孔的形成。对抗原使用串联质谱分析表明MAB能识别精子顶体素(精子头粒蛋白)。免疫组化分析和超微结构分析发现精子顶体素位于精子细胞质膜和顶体基质中。事实表明，MAB确能有效地阻止有完整顶体的精子与卵周膜结合。尽管精子顶体素ZP蛋白的结合能力还未知，但这些研究结果表明在鹌鹑受精过程中，精子质膜上分子量为45 kDa的精子顶体素有助于精子与卵周膜结合。

2 精子的顶体反应

某些组分，通过精子的细胞质膜和顶体外膜的融合，精子会释放出头部顶端的顶体泡内含物，此过程被称为顶体反应(Acrosome Reaction，AR)。顶体反应使顶体内膜(Inner Acrosomal Membranes，IAM)暴露，IAM内的蛋白质如IZUMO 1蛋白被激活。不同动物顶体反应的诱导物不同。在海胆类生物中，当精子到达卵子外基膜(胶膜)时发生顶体反应，胶质中的海藻糖硫酸酯聚合物作为顶体反应的诱导物。在海星中，糖蛋白(顶体反应诱导物：Acrosome Reaction-Inducing Substance，ARIS)和甾体皂苷(ARIS辅助因子)的混合物或由34个氨基酸残基组成的多肽Asterosap，均具有诱导顶体反应的潜能。类似的，非洲爪蟾输卵管直段分泌的分子量为300 kDa的糖蛋白ARISX已被证实为其顶体反应诱导物，在小鼠和人中，孕酮具有诱导精子顶体反应的功能。人们普遍认为，顶体反应对释放顶体基质内含物非常重要，释放的精子顶体素能消化卵膜，形成便于精子穿透的通道。然而，最近多项研究发现，小鼠中大多数精子在到达透明带前已完成顶体反应，且已经进入卵周隙的精子具有再次穿透透明带的能力。从这些观察结果来看，很显然我们需要重新思考之前对哺乳动物受精过程中顶体反应作用的认识。

在禽类中，研究发现精子顶体反应的诱导活性发生在卵周膜中。鸡卵周膜中的N-连接寡糖和末端N-乙酰葡萄糖胺残基掌控着顶体反应诱导活性的证据来自十多年前的研究报道。然而，卵周膜中何种成分才是真正起作用的顶体反应诱导物，这在所有禽类中仍然未知。为了鉴定日本鹌鹑卵周膜中顶体反应的诱导物，我们建立了一种在显微镜下从顶体完整的精子中辨别发生顶体反应的精子的方法。由于烟酸己可碱(Hoechst)33342染色负性结构定位于精子核顶端，鹌鹑精子顶体可清晰地被检测到(图2)。通过这个方法，我们发现日本鹌鹑中卵周膜ZP1蛋白具有诱导顶体反应的活性，同时我们也证实了附着于ZP1蛋白上的N-连接寡糖在驱动顶体反应中起着重要的作用。与我们的研究结果相一致的是，Okumura及同事发现当采集的精子用纯化的ZP1或ZPD蛋白(鸡卵周膜中另一微量组分)共培养时，顶体反应可诱导发生。这些结果使我们确信禽类精子顶体反应的诱导发生在卵周膜表面，这与小鼠中的情况不同。

从介导顶体反应的信号转导方面来看，研究表明哺乳动物精子的Gi蛋白参与此过程，因为百日咳毒素(Pertussis Toxin，PTX，Gi蛋白功能抑制剂)，会抑制哺乳动物精子中ZP蛋白诱导的顶体反应。很有意思的是，有研究报道PTX并不会抑制人和小鼠精子中由孕酮诱导的顶体反应以及小鼠中乙酰胆碱诱导的顶体反应，这其实是一种PTX不敏感受体参与了顶体反应诱导过程。这些资料提示不同的生理刺激可利用不同的信号转导通路来诱导精子顶体反应，不过双重信号转导系统存在的生理重要性仍有待解析。我们之前对日本鹌鹑的研究显示，当PTX被加入培养混合物中时，ZP1和A23187蛋白诱导的顶体反应均受到明显的抑制。这些结果表明ZP1或A23187蛋白可能通过Gi蛋白介导机制起作用，这类似于哺乳动物精子中透明带启动的精子顶体反应。

3 负责消化卵周膜的蛋白酶

虽然以上机制仍存在争议，但人们普遍认为精子携带的蛋白酶能水解卵子外膜，由此蛋白酶形成的小孔为精子穿透提供通道。另外，人们长期以来一直认为：哺乳动物中的精子顶体素(即位于精子头部的非ATP依赖性丝氨酸蛋白酶)在精子的穿透过程中是必不可少的。然而，Baba等的研究证明敲除顶体素的雄性小鼠仍能产生活动能力正常且具授精能力的精子。因此，至少对小鼠而言，精子顶体素对受精并不是必需的。目前，顶体素可以被认为负责分散顶体反应中精子顶体内含物。Sawada等报道在海生无脊椎动物如海鞘、海胆中，精子蛋白酶体负责精子穿透卵质膜。蛋白酶体是一种被称为细胞溶解酶的溶解剂，它对溶解卵子外基质是不可或缺的。相似的结论可在小鼠、猪及人等哺乳动物的受精过程中获得。

在禽类中，受精发生在输卵管的漏斗部，在受精时仅卵周膜包裹着卵子。如上所述，禽类精卵互作是可以在体外依照精子在卵周膜上形成小孔的能力进行估量。通过抑制顶体反应，添加PTX，我们发现位于精子质膜上分子量为45 kDa的顶体素负责精子与卵子卵周膜的结合，但它对卵周膜糖蛋白的消化并不重要。这些结果表明：在禽类受精过程中真正起作用的细胞溶解酶不是顶体素，而是存在于精子中的另一蛋白酶。为了鉴定真正的禽类细胞溶解酶，我们之前曾检测了精子蛋白酶体在日本鹌鹑受精过程中的作用，结果发现随血液循环的ZP1蛋白在运输至卵周膜过程中得到了某些修饰。这是从以下试验获得的结论：在对从产蛋鹌鹑血清中获得的ZP1蛋白进行纯化后，将其经静脉注入不同禽类，外源性ZP1蛋白信号可以在卵周膜中检测到。然而从卵周膜分离的ZP1蛋白还能不能进入到卵周膜。如前文所提到的，卵膜蛋白ZP1是禽类真正的顶体反应诱导物。我们也测试了血清ZP1蛋白是否也能诱导日本鹌鹑的顶体反应；结果发现两种ZP1蛋白均能诱导顶体反应，但免疫印记分析表明抗泛素抗体只与卵周膜ZP1蛋白互作。这些结果表明血清ZP1蛋白在运输过程中在细胞外受到泛素化作用，同时与ZP3蛋白结合并在卵周膜上形成不溶性纤维(图3)。当血清ZP1蛋白或卵周膜ZP1蛋白在与精子共培养时，我们再次发现仅卵周膜ZP1蛋白被水解为小段肽链。利用抗20S蛋白酶体抗体的蛋白印迹(Western Blot，WB)分析和超微结构分析发现免疫反应性蛋白酶体位于精子的顶体区域。在培养混合物中添加特定的蛋白酶体抑制剂MG132，或通过添加三磷酸腺苷双磷酸酶使细胞外ATP耗尽，均能有效抑制精子在卵周膜的穿透。这些结果清晰地证明了精子蛋白酶体在禽类受精中的重要作用以及ZP1的细胞外泛素化可能发生在经血液循环的运输过程中(图3)。尽管我们有很多研究证据显示泛素-蛋白酶体系统对鹌鹑精子受精中在卵周膜上孔形成和之后精子穿透起卵周膜着重要的作用(图4)，但顶体素(即顶体丝氨酸蛋白酶)仍被确信为参与了受精过程中卵周膜孔的形成。正如在大多动物中研究所揭示的，泛素-蛋白酶体系统在动物受精中的作用可能是普遍保守的。其中，禽类泛素-蛋白酶体系统是研究受精过程中精子蛋白酶作用的有利模型，因为禽类精子能在卵周膜上形成一个较大的孔，且大量的靶蛋白ZP1可以从较大的卵子分离到。

大多数动物排出的卵子只接收一个精子形成合子，因为卵子内有一个阻断系统以防止多精进入。最近对小鼠进行的研究发现，卵皮质颗粒蛋白酶Ovastatin对阻挡多精入卵是必不可少的；Ovastatin能部分水解ZP2蛋白，因而精子不会再与经Ovastatin修饰的透明带互作。以非洲爪蟾的受精为例，当第一个精子进入卵子后不久，卵子质膜会迅速发生改变，通过诱发正向受精能力，来防止第二个精子的融合，以此迅速阻止多精入卵。与这些单精受精系统相比，禽类的卵子在受精过程中可以接受很多精子并进行多精受精。

这种生理情况表明在禽类受精过程中没有阻止多精入卵的分子机制。我们最近在鹌鹑上利用胞浆内单精子显微注射技术(Intra-Cytplasmic Sperm Injection，ICSI)证实了禽类多精受精是必要的，因为禽类较大的卵子需要更多能够负责激活卵子和之后胚胎发育的精子。可以合理假设：缺乏阻止多精入卵的机制且需要大量精子因子激活大型卵子的这两种现象是禽类在进化中获得的能力。

4 结论

本文中我们介绍了近年来关于禽类精卵互作的研究成果。哺乳动物和禽类受精系统的比较如图5所示。多种调控禽类受精的重要分子已被找到，但这主要是参照哺乳动物的研究而获得的。因目前尚无通过转基因技术获得基因操作禽类的有效方法，有关禽类受精机制的知识还非常有限。我们最近的研究显示利用ICSI技术能成功孵化出健康的小鸡。用ICSI技术成功获得健康鸡对家禽业、农业及禽类保护(包括转禽基因、克隆技术以及保护濒危禽类)都有巨大的意义。结合ICSI技术和现代技术如CRISPR/Cas9系统，我们预期在不久的将来通过ICSI技术我们将能够生产转基因禽和基因敲除禽。我们也希望ICSI技术能帮助于我们了解禽类受精作用和胚胎发育机制的机制以及禽类生物学其他领域的知识。□□

原题名：Sperm-Egg Interaction during Fertilization in Birds(英文)

原作者：Yoshinobu Ichikawa、Mei Matsuzakil、Gen Hiyama、Shusei Mizushima和Tomohiro Sasanamil

S831.3

C

1001-0769(2016)12-0027-05