贾利宁　杨　阳　高　明　马晓桃　张星映　付荣国

西安交通大学第二附属医院肾病科(西安 710004)



六味地黄汤联合来氟米特、泼尼松治疗大鼠IgA肾病的研究*

贾利宁杨阳△高明▲马晓桃张星映付荣国□

西安交通大学第二附属医院肾病科(西安 710004)

摘要目的：探讨六味地黄汤联合来氟米特、泼尼松对大鼠IgA肾病的作用及其可能的机理。方法：第12周末造模成功后，随机分为模型对照(M)组、来氟米特和泼尼松(LP)组和中药(C)组、来氟米特、泼尼松联合中药(LPC)组和正常对照(K)组，检测24小时尿蛋白、尿红细胞、肾功、血浆白蛋白。肾组织行HE、PAS、P+M及免疫荧光染色；RT-PCR检测足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin和podocin mRNA的表达。结果：与其他组相比，LPC组尿蛋白、尿红细胞明显减少，血清BUN、SCr明显下降，HE、PAS染色、P+M染色提示肾组织病理损害程度相对较轻，免疫荧光提示肾小球系膜区IgA沉积相对明显减少，且肾组织nephrin、podocin mRNA表达上调。结论：六味地黄汤联合来氟米特、泼尼松能够延缓肾脏损害的进展，其作用机制可能与上调Nephrin、Podocin的表达，抑制系膜细胞增生，减少系膜区免疫复合物沉积有关。

主题词肾病 动物，实验大鼠

近年来，IgA肾病在原发性肾小球疾病中所占的比例升高，虽然IgA肾病进展较为缓慢，但仍有15%～25%的患者在10年内进展至终末期肾病[1]。因此，控制IgA肾病的进展、延缓终末期肾病的发生是肾脏疾病治疗的主要目的。传统的西药对IgA肾病蛋白尿的治疗停滞不前，因其严重的毒副作用使应用受到一定限制[2-3]。随着中医学的发展，中药的应用越来越多，特别是中西医结合治疗IgA肾病是目前控制IgA肾病进展的最佳方案[4-5]。本研究探讨来氟米特、泼尼松联合中药六味地黄汤方案对大鼠IgA肾病的作用及其可能的机理。

1材料雌性健康SD大鼠42只，随机分为正常对照(K)组和模型组，其中正常对照组7只，造模组35只，采用口服免疫原BSA(牛血清白蛋白)皮下注射四氯化碳，并联合运用LPS(脂多糖)尾静脉注射制造IgA肾病模型[6]。

2实验方法2.1药物第12周末分别在正常对照组和造模组随即选取大鼠处死，留取肾组织标本，并初步验证造模成功后，剩余造模大鼠随机分为模型对照(M)组、来氟米特+泼尼松(LP)组和中药(C)组、来氟米特+泼尼松+中药(LPC)组，并分别给予等量生理盐水、来氟米特+泼尼松混悬液、中药汤剂、来氟米特+泼尼松混悬液+中药汤剂灌胃，泼尼松按3mg /kg/d给药，来氟米特按10mg/kg/d给药，中药方剂在六味地黄汤基础上加减化裁而成，组方包括：黄芪60g，丹参30g，生地、熟地各30g，山药、山萸肉、丹皮、茯苓、泽泻、枸杞子、菟丝子各12g，焦三仙(焦麦芽、焦山楂、焦神曲)各12g，二冬(天门冬、麦门冬)各12g，甘草6g。

2.2检测项目定期收集大鼠尿标本检测尿红细胞尿蛋白。第18周末实验结束后处死大鼠，收集大鼠血标本检测肾功、血浆白蛋白，取肾组织液氮处理后置于-80℃冰箱保存，分别做普通光镜HE、PAS染色、P+M染色及免疫荧光染色和RT-PCR检查。普通光镜下观察病理情况，免疫荧光染色观察肾小球系膜区IgA沉积情况，RT-PCR检查肾脏足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin和podocin mRNA(NPHS1、NPHS2)表达。Nephrin(NPHS1)和podocin(NPHS2)引物设计与合成据Genebank查询结果得到，序列如下：Sequence Name:NPHS1(230bp)； Forward Primer: 5-GCGTCAGCATCAGCAGCAAC-3； Reverse Primer: 5-CAGCACATTGAAGCGGTAGAAGG-3。(2)Sequence Name:NPHS2(167bp)； Forward Primer: 5-GGATGGCGGCTGAGATTCTGTC-3； Reverse Primer: 5-GATGCTTCCTTGTGCTCTGTTGC-3。

2.3统计学方法各检测结果用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验法，数据用SPSS18.0统计软件处理，P<0.05认为数据间的差异有统计学意义。

3结果3.1 模型验证实验第12周末，随机抽取的造模大鼠24小时尿蛋白(38.70±2.74 mg)明显高于正常对照组(2.88±2.09 mg)，差异具有统计学意义(P<0.05)。疫荧光示造模组各大鼠大部分肾小球系膜区IgA团块状沉积，而正常对照组未见上述改变，进一步验证造模成功。

3.2治疗后各组24小时尿蛋白定量、血尿的变化经治疗6周后，与M组比较，尿蛋白、尿红细胞在各治疗组均有下降，除 C组治疗效果稍差，其余各组均有统计学差异(P<0.05)；与其余各组比较，LPC组尿蛋白下降最为明显(P<0.05)，但LPC组尿红细胞与LP组无统计学差异(P>0.05)，与C组比较差异有统计学意义(P<0.05)；LP组与C组之间比较，LP组较C组效果更明显，两指标差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

3.3各组血浆白蛋白、尿素氮、肌酐的变化经治疗6周后，与M组相比，其余各组血浆白蛋白升高，尿素氮、血肌酐下降，其中C组治疗效果稍差，与M组比较除尿素氮有统计学差异外(P<0.05)，其余两指标均无统计学意义(P>0.05)；LPC组与其余各组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)见表2。

3.4RT-PCR检测肾组织Nephrin和Podocin的表达将PCR产物带用凝胶图像处理软件进行条带半定量分析，转化成数值型变量。以GADPH为内参，NPHS1/GADPH、NPHS2/GADPH计算nephrin和podocin的mRNA的相对表达量，如下表3。研究发现联合治疗组比两单药使用，具有更明显的上调nephrin、podocin mRNA的作用(p<0.05)，见图1。

图1各组大鼠肾组织Nephrin和Podocin mRNA表达

3.5各组大鼠肾脏病理学检测①HE染色M组可见系膜细胞及基质中度增生，炎性细胞浸润，肾小球基底膜增厚，小血管硬化，管腔变窄，C组病变较M组稍轻，LP组及LPC组病理损伤程度明显减轻，系膜细胞及基质轻度增生，LPC组疗效最佳，空白对照组未见上述明显变化，见图2。

②PAS染色 M组看见肾小球系膜细胞和基质明显增生，肾小球体积轻度增大，部分球囊粘连，C组病理损害稍轻，LP组和LPC组较前两组明显好转，肾小球增生程度减轻，肾小球基底膜完整，其中LPC组病理损害最轻。正常肾小球未见上述变化，见图3。

③ P+M染色M组看见肾小球系膜细胞和基质明显增生，肾小球肿胀，可见上皮下嗜复红蛋白沉积，C组病理损害稍轻，LP组和LPC组较前两组明显好转，肾小球增生程度减轻，肾小球基底膜完整，未见嗜复红沉积物，其中LPC组病理损害最轻。正常肾小球未见上述变化，见图4。

④IgA免疫荧光强度比较：M组肾小球系膜区可见免疫荧光团块样沉积，C组较M组稍弱，LP及LPC组荧光较暗，强度较弱，正常对照组无或仅有少量免疫复合物沉积，并对荧光强度进行分析。M组与正常组有显著差异，LP组与模型组比较有显著差异，LPC组与模型组、C组有显著差异。见表4。

注：(-)表示阴性；(±)表示高倍镜下似乎可见；(+)表示低倍镜下似乎可见，高倍镜下明显可见；(++)表示低倍镜下明显可见，高倍镜下清晰可见；(+++)表示低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼；(++++)表示低倍镜下耀眼，高倍镜下不刺眼。

4讨论自IgA肾病发现以来，对其研究越来越多，但至今本病的发病机制仍不甚清楚。IgA肾病临床表现多样，病理类型复杂，治疗存在诸多困难。现有的研究表明激素能够减轻蛋白尿，减少发展至终末期肾病的风险，但其对肾脏的保护作用还不是很清楚[7-8]。意大利的一组调查研究显示，激素有10年的后续治疗效果，可明显减轻尿蛋白，延缓肾脏病的进展[9]。然而大剂量激素可能导致严重的毒副作用。而最新随机对照研究发现，激素仅能适度减轻蛋白尿，并不能保护肾小球滤过率[10-11]。我们通常认为，尿蛋白量>1g/24h的患者需使用糖皮质激素，加用大剂量ACEI/ARB控制血压，保护肾脏功能[12]。国内张虹等[13]选取31例原发性IgA肾病患者，用来氟米特联合小剂量激素进行治疗，疗程3个月，结果发现表现为单纯发作性血尿和镜下血尿，病理积分较少者疗效较好，对于临床表现为大量蛋白尿或肾病综合征者疗效较差，治疗过程中有4例出现来氟米特相关副作用。因此，我们需一种药物，能够减轻激素及其他免疫抑制剂的毒副作用，并能进一步加强其治疗作用，而我们的中药方剂就是此类药物之一。陈淑娟等[14]发现中药联合替米沙坦治疗IgA肾病疗效显著，改善患者临床症状，保护肾功能，延缓IgA肾病的进展。IgA肾病多以气阴两虚者多见，蛋白尿的发生多数以肝肾阴虚为常见症候群。六味地黄汤具有益气养阴、滋补肝肾、清热凉血等功效，其治疗肾脏疾病历史悠久，本方剂是在六味地黄汤基础上加减多味中药而成，对气阴两虚、肝肾阴虚者，尤为有效。近年来六味地黄汤对糖尿病肾病大鼠治疗效果文献报道较多，但对IgA肾病的作用研究较少，本实验通过基础实验研究，进行严格的对比观察，证明了六味地黄汤在治疗IgA肾病上的功效[15]。

本研究发现中药组虽然能减轻蛋白尿，减少系膜区IgA沉积，稳定肾功能，但与模型组相比除尿素氮外其余各项均无统计学差异，提示其单独使用中药六味地黄汤对IgA肾病的治疗作用较弱。但来氟米特、泼尼松联合中药六味地黄汤能够明显降低IgA肾病大鼠蛋白尿，改善肾功能，认为IgA肾病的发病可能与nephrin、podocin分子表达异常导致肾脏滤过屏障损伤，尿蛋白产生、肾功能损害关系密切[16-17]。从病理上，我们观察到LPC组除系膜细胞增生减轻，系膜区免疫复合物沉积减少外，同时肾小球毛细血管管壁与血管周径之比明显小于LP组，其机制可能与中药具有保护内皮、抗动脉粥样硬化等有关。中药方剂中所含的黄芪、丹参等中药可以减少内皮细胞释放血浆血栓素、内皮素和一氧化氮，提高内皮细胞存活率及SOD活性，降低乳酸脱氢酶活性等，达到保护血管内皮的作用，还可以通过抑制内源性胆固醇的合成，抗脂蛋白的氧化，抑制单核细胞趋化蛋白-1，对抗H2O2诱导的平滑肌细胞凋亡，抑制平滑肌细胞增殖相关基因c-myc表达等作用[18-19]。

综合分析，泼尼松、来氟米特联合中药六味地黄汤通过不同靶点药物的协同作用，达到更好的治疗IgA肾病的效果。实验过程中未发生严重的不良作用。可能为临床中西医联合治疗IgA肾病提供理论依据，并为其他免疫抑制剂联合中药治疗IgA肾病的研究提供一定的启发。

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(收稿2015-11-23；修回2015-12-25)

通讯作者□

【中图分类号】R573

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.03.051

*陕西省自然科学基金资助项目(2015JM8429)

△延安大学附属医院消化内科(延安 716000)

▲西安市第四医院肾内科(西安 710004)