孟祥黔 龚 艺 熊 符 何 菲 全 松** 刘 敬**

1. 四川省成都市锦江区妇幼保健院生殖医学中心（成都 610066）；

2. 南方医科大学南方医院妇产科生殖医学中心；3 南方医科大学遗传教研室

人类精子空泡及中心体形态对ICSI患者胚胎发育的影响*

孟祥黔1龚 艺2熊 符3何 菲3全 松2**刘 敬1**

1. 四川省成都市锦江区妇幼保健院生殖医学中心（成都 610066）；

2. 南方医科大学南方医院妇产科生殖医学中心；3 南方医科大学遗传教研室

目的利用精子放大系统将精子放大6 000倍后，观察精子是否含空泡及精子中段形态，探讨精子空泡及中心体形态对行卵泡浆内单精子显微注射（ICSI）患者的胚胎发育的影响。方法 57例来自成都锦江生殖中心因男方因素行ICSI患者，常规挑选完形态正常的精子（×200～×400）后，再次利用精子放大系统对精子有无空泡和精子中段形态进行观察。根据精子中段形态将精子分为三类，A类：1≤a/b≤1.2；B类：a/b≥1.5；C类：其他不规则形态。有无空泡和精子中段组分为：空泡-A，空泡-B，空泡-C，无空泡-A，无空泡-B，无空泡-C。随后按照常规ICSI注射后培养，并观察胚胎发育情况和患者临床结局。结果空泡-A、B、C3组在2PN率、D3优胚率、可用囊胚率及胚胎冷冻率上均无显著性差异（P＞0.05）；无空泡-A,B,C三组的可用囊胚率上无显著性差异（P＞0.05），而2PN率（74.48 % vs 84.62 % vs 57.14%），卵裂率（96.17% vs 97.06% vs 80.95%），D3优胚率（35.48% vs 39.39 %vs 9.09%）、D6囊胚形成率（21.05% vs 34.78% vs 0），胚胎冷冻率（31.25 % vs 26.92% vs 0）均有显著性差异（P＜0.05）。另外A组中有无空泡中，仅仅胚胎冷冻率上具有显著性差异（P＜0.05），B组中2PN率具有显著性差异性（P＜0.05），C组中可用囊胚率和胚胎冷冻率具有显著性差异（P＜0.05），3组中其余指标均无显著性差异（P＞0.0）。结论精子头部无空泡和中心体形态较好的精子注射入卵后，能提高2PN率、D3优胚率、胚胎冷冻率。由于样本量较少，仍然需要较大的样本量来进一步证实，为精子空泡以及中心体对胚胎发育影响的相关研究提供参考。

精子注射, 细胞质内；精子；空泡；中心体；胚胎发育

据国内外研究显示，不孕不育夫妇中约40%是由男方因素引起，其中50%的不育男性精子形态表现异常［1］。许多研究者认为精子形态与精子功能密切相关，精子形态异常是导致男性不育的重要原因之一［2］。传统卵泡浆内单精子显微注射（ICSI）在光镜（×400）下挑选精子可能存在超微结构异常，这些异常可能是导致ICSI周期失败的原因［3,4］。因此，在显微注射治疗中挑选一条形态正常的精子是非常关键。MSOME（精子细胞器形态学检查）［5,6］是由Berkovitz在2002 年提出的一项新技术，通过高质量的光学系统将精子放大6 000倍，并通过数字化处理图像，在电脑显示器上对精子进行实时的形态学评估，有利于发现精子微细胞器（如：顶体、顶体后区、颈部、尾部、中心体形态）形态结构的异常。

精子核的形态以及精子头部是否含空泡目前被认为是形态学判定的关键指标，迄今为止，关于精子空泡出现频率、起源等仍存在争议，有研究认为空泡的出现是一种正常的生理现象［7-9］，也有研究表明在不育男性精液中含空泡精子的比例高于有生育能力的男性［10］；同时，也有研究指出空泡的存在与精子内部生理功能的异常有关［11-15］，含有空泡的精子可能通过ICSI技术突破自然屏障，使卵母细胞受精，将异常的遗传物质带入受精卵中，并通过父源性作用影响胚胎的质量及发育潜能。另外精子中心体异常也可能是导致男性不育的因素且扮演着重要的角色［16］，当卵母细胞被精子激活后，排出第二极体，此时精子近端中心粒降解，以颈部中段的中心粒为中心形成精星体［17,18］，通过精星体的牵引，雌雄原核逐渐靠近融合形成受精卵。中心粒在原核期开始复制后均分至第一次胚胎分裂的纺锤体两极，合子的中心体是胚胎、胎儿和成年体细胞中心体的前身［19］。因此，精子中心体对于卵母细胞的正常受精、精星体的形成以及雌雄原核的形成起着关键性的作用。行ICSI治疗受精失败可能是中心体功能异常所致［20］。2010年Ugajin［21］的科研小组提出，从形态学角度分析，精子段中心体形态异常涉及到精子中心体功能异常，从而可能会影响ICSI治疗结局。

然而，大多数研究都是通过动物模型中精星体的形成来研究中心体功能，未见关于人类精子中心体形态的相关研究，本研究低倍镜观察后考虑到精子空泡和中心体形态对于助孕结局的影响。借助MSOME技术对ICSI患者的精子放大6 000倍对其按照精子头部空泡的有无，精子中心体形态进行分组，随后将不同组别的精子注射入卵母细胞并单独培养，观察正常受精、胚胎发育和胚胎着床情况，进一步了解空泡及精子中段形态对胚胎发育的影响。

资料和方法

一、研究对象

选择2014年1月至11月在成都锦江妇幼保健院接受辅助生殖治疗的患者57例，其中9例患者为重复周期。所有患者均接受来自同一位医生的诊治，并且所有患者治疗过程中都采用的是常规促性腺激素释放激素激动剂长方案控制性卵巢刺激周期促排卵，所有患者行显微注射。ICSI指征［22］：（1）严重少、弱、畸精子症；（2）不可逆的梗阻性无精子症；（3）生精功能障碍（排除遗传缺陷疾病所致）；（4）男性免疫性不育；（5）体外受精（IVF）失败；精子顶体异常。

二、促排卵方案

控制性超排卵［23］：超排卵为标准长方案或短期方案（根据患者自身情况决定其方案的选择，两种促排方案在MII卵率上均无显著性差异），B超监测卵泡生长发育状况，待优势卵泡直径≥18mm时肌肉注射HCG 10 000IU，36h后在B超介导下经阴道穿刺取卵。

三、研究对象分组

57例研究对象的精子标本按照MSOME高倍镜观察下中心体形态以及头部有无空泡进行分组。高倍镜下观察到精子的中心体形态可分为三类［21］：由图1可见A类为1≤a/b≤1.2，B类为a/b≥1.5，C类为其他形态不规则；按照头部空泡的存在情况可分为：有空泡类精子和无空泡类精子。最后，根据这两个观察指标对所有精子分成6组：空泡-A组（n=79）、空泡-B组（n=7）、空泡-C组（n=17）、无空泡-A组（n=377）、无空泡-B组（n=39）、无空泡-C组（n=35）。

图1 精子中心体形态A类、B类示意图

四、方法

（一）卵母细胞的采集与处理

所有患者均使用常规激动剂长方案控制性卵巢刺激周期促排卵：黄体中期予以促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a ，达必佳，FERRING, 瑞士）0.05mg肌注，降调≥14d时，测定激素水平（E2、LH、FSH）、子宫内膜厚度、窦卵泡直径，确定达到降调标准后予以重组卵泡刺激素（rFSH，果纳芬，Merck Serono，德国）150U～300U对卵巢进行刺激，并根据B超监测的卵泡情况和血清LH、E2水平调整重组卵泡刺激素的用量。当B超监测下有3个主导卵泡直径＞18mm后，给予重组人绒毛膜促性腺激素（rHCG, 艾泽, Merck Serono,德国）250mg肌注，36h后在B超介导下经阴道穿刺取卵。将获得的卵母细胞于透明质酸酶（Hyaluronidase, 80U/mL, Sage, 美国）中消化去除颗粒细胞后，置于含Vitrolife序贯培养液（G-IVF, Vitrolife, 瑞典）的培养皿中放置37℃、6% CO2的培养箱（Thermo Scientific Forma 3110, 美国）培养备用。

（二）精子的准备

TESA取精患者的精子准备：采用睾丸细针抽吸术获取睾丸组织,加入含1 0%替代血清白蛋白（SPS,Sage,3010-12）的缓冲培养液（mHTF,Sage,1023）中研磨,经洗涤后获得睾丸精子。新鲜精液的精子准备：患者取精前禁欲3～7d，取卵日当天采用手淫法取精，患者精子采用梯度离心法进行洗涤。将洗涤好的精液加入精子缓冲液（mHTF,Sage,1023）中混匀后置于37℃、6% CO2的培养箱中备用。

（三）显微注射

将处理后的精液吸取少许加入注射皿中的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或缓冲液液滴里，然后在400倍显微镜（NIKON TE-2000U，日本）下挑选精子形态正常的精子（挑选时主要观察指标：精子顶体形态、头部形态、颈部形态及颈部液滴、尾部形态，要尽量挑选前向运动的精子，如果死精子较多时可选微动精子或尾部弯曲的精子），观察到所要挑选的精子后，用注射针在精子尾部靠近头部的1/3处迅速制动（当看到精子尾部明显折痕时，表示制动完成），随后，从尾部吸入被制动的精子放置在PVP标记过的位置，之后把准备好的卵母细胞转入注射皿的缓冲液滴（G-mops，Vitrolife，瑞典）中，极体位于6点或12点方向进行注射。

（四）精子放大系统的使用

本研究使用精子放大系统结合ICSI（简称IMSI）技术。具体操作如下。用含10%替代血清白蛋白（SPS, Sage, 3010-12）的缓冲培养液（mHTF, Sage,1023）于玻璃底的平皿（Delta T Dish ,USA）中做数个液滴，在液滴中加入传统放大倍数（400倍）下挑选的形态正常的精子，用无菌石蜡油（Oil, Sage, 4008P）覆盖，利用精子放大系统（OCTAX CytoScreenTM, 德国）于6000倍的显微镜视野下进行放大观察［24］，并对精子进行拍照，然后测量每个挑选精子的中段形态并分A、B、C 3类［21］，同时记录精子中有无空泡的情况，以及空泡的位置、直径。最后将全部精子分为空泡-A、空泡-B、空泡-C、无空泡-A、无空泡-B、无空泡-C 6组。在整个实时观察过程中不会对精子造成任何损伤，观察结束后依然按照显微注射流程进行注射，注射时按照顺序一一对应的将精子注射入卵，随后按照注射顺序进行单独培养，以便观察精子形态对胚胎发育的影响，见图2。

图2 IMSI下观察精子形态（×4000）

（五）胚胎培养及质量评分

显微注射后的卵子、受精卵及胚胎均置于IVF序贯培养液（卵裂期胚胎用G-1/囊胚用G-2，Vitrolife,瑞典）中，在37℃、6% CO2的培养箱（Thermo Scientific Forma 3110, USA）中培养。显微注射16～20h后观察受精情况，出现两原核为正常受精。胚胎的评估采用本实验室常规评分法（D3胚胎采用WIH评分法［25］，囊胚采用Gardner评分法［26］）对胚胎进行评分。

D3胚胎评分：（1）卵裂球个数用阿拉伯数字记录；（2）碎片比例，碎片是在卵裂过程中产生的被细胞膜包绕但不含细胞核的细胞质，无碎片记4分，碎片比例占卵裂期胚胎10%以内的记3分，10～25%记2分，26～50%记分，大于50%记0分；（3）卵裂球对称性，卵裂球之间大小接近（对称）记1分，大小形态差异明显（不对称）记0分；（4）细胞核个数，观察卵裂球中细胞核的数量，正常为一个卵裂球包含一个细胞核，多余的称为多核现象；（5）胞浆特性，记录是否有细胞器聚集、空泡、滑面内质网丛；（6）融合现象及桑葚胚，卵裂球个数超过16的卵裂期胚胎为桑葚胚，当卵裂球之年界限不清晰，形成一个类似融资一起的整体称为融合现象，所有卵裂球均参与融合记为融合Ⅰ，50%以上卵裂球参与融合记为融合Ⅱ，低于50%卵裂球发生融合记为融合Ⅲ；（7）评分体系，依次按照卵裂球个数、碎片比例、卵裂球对称情况三项指标构成。D3优质胚胎评定：D1为2PN、D2卵裂球个数在3～5，碎片评分3分或以上、D3卵裂球个数在7～9，碎片评分在3分或以上、融合I和II、未见多核卵裂球、未见空泡。

D5/6囊胚评分：（1）1期：早期囊胚，囊胚腔小于胚胎体积的一半；2期：囊胚腔大于胚胎体积的一半；3期：囊胚腔几乎充满整个胚胎；4期：扩张囊胚，胚腔大于早期囊胚，透明带变薄；5期：正在孵出的囊胚，一部分从透明带孵出；6期：完全孵出的囊胚；（2）3～6期的囊胚内细胞团和滋养层细胞评分：内细胞团的评分：A级：细胞数多，紧密；B级：细胞数少，松散；C级：细胞数很少。滋养层细胞的评分：A级：上皮细胞层由较多细胞组成，大于10个细胞，排列紧密；B级：上皮细胞层由少的细胞组成，排列松散；C级：上皮细胞层由稀疏细胞组成；（3）囊胚期胚胎评分体系：依照囊胚的扩展和孵化程度、内细胞团、滋养层细胞，此三项指标构成评分主要体系。根据这个评分方法,第5d最好的囊胚评分应该是4AA；（4）囊胚期优质胚胎评估标准：3～6期囊胚且内细胞团或滋养层细胞有一个评为B级及以上的囊胚。（5）可用囊胚：D5移植或达到冷冻标准的囊胚。

（六）胚胎冷冻标准

卵裂期胚胎冷的标准：D3优质胚胎或D3卵裂球在6细胞以上、碎片评分在2分以上；囊胚冷冻标准：囊胚在3期及3期以上，评分在CC及CC以上。

（七）胚胎移植与妊娠结果判断

选择评分最高的胚胎或囊胚1～2个在B超下移植，移植后12d检测血hCG水平以确定是否生化妊娠，移植后4周超声检查示子宫腔内出现孕囊及胎心搏动即确定为临床妊娠。

五、统计学分析

实验结果采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，实验结果以百分率表示，各组受精率、优胚率、可用囊胚率、胚胎冷冻率的比较采用R×C表卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、精子中心体形态对胚胎发育的影响

比较空泡组中不同中心体形态的精子注射入卵后的胚胎发育情况，结果表明：空泡-ABC 3组2PN率、D3优胚率、可用囊胚率、胚胎冷冻率均无显著性差异（P＞0.05），而D6囊胚形成率有显著性差异。无空泡组中不同中心体形态的精子注射入卵后的胚胎发育情况，结果表明：无空泡-ABC三组可用囊胚率和D5囊胚形成率无显著性差异（P＞0.05），2PN率、卵裂率、D3优胚率、D6囊胚形成率、胚胎冷冻率均有显著性差异（P＜0.05）。

二、精子空泡对胚胎发育的影响

对中心体形态为B类的精子进行比较，发现无空泡精子注射后2PN率明显高于空泡精子（P＜0.05）；中心体形态A类、B类的精子中无空泡精子在D3优胚率高于空泡精子，但无显著性差异（P＞0.05），而中心体形态A类中无空泡精子组的胚胎冷冻率显著高于空泡组（P＜0.05），而C类中则是空泡组显著高于无空泡组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组不同中心体形态的精子注射入卵后的实验室指标比较 ［n（%）］

讨 论

MSOME技术的出现给了我们一些提示——精子空泡、精子中段形态与男性不育是否存在某些关联？精子形态异常是否会影响胚胎发育？这些问题都值得我们不断的探索。目前关于精子空泡的相关研究较多［8,11-15,27］，而精子中心体形态与胚胎发育关系的研究较少。在胚胎发育阶段，来自父源性的遗传物质对胚胎的影响从受精时便开始作用，一直持续整个胚胎发育过程。受精卵中mRNA的转录开始于4～8细胞阶段（mRNA大多来自卵母细胞的胞质），这标志着父方基因的开始表达。当精子遗传物质存在缺陷，将会影响父方基因的表达，从而导致胚胎在5～8细胞阶段及后续发育过程中缓滞，这种现象称为后期父源性影响［28］。然而，异常精子也可以通过很多机制影响受精卵基因组转录前阶段的胚胎发育，例如受精失败、胚胎碎片的形成以及胚胎早期卵裂发育阻滞等，这些影响称为早期父源性影响［29］。由此可见，精子在胚胎发育过程中的影响是至关重要的。

Watanabe［30］和Tanaka［8］认为无论男性是否具备生育能力，精子空泡大多数出现在精子顶体区域或核区域。精子头部顶体中出现的微小空泡和顶体的异常及顶体反应缺失相关［31］。精子头部出现较大空泡时（空泡占精子头部体积＞4%），精子染色体发生异常解聚的比例要高于那些不含空泡的精子［32,33］。2008年，Vanderzwalmen等［34］将精子分为三类，第一类：精子头部形态正常，无空泡或者空泡体积＜头部4%；第二类：精子头部形态正常且最多含2个小空泡；第三类：精子头部形态正常伴多个小空泡或精子头部形态异常。比较后发现三者受精率并无显著性差异，而第三类精子在形成胚胎后，在D3优胚率和囊胚形成率上明显低于前两类。精子头部空泡体积大于4%时，精子DNA碎片发生率显著高于形态正常的精子，DNA链的断裂会影响卵裂球细胞基因组的复制及表达过程，破坏细胞的稳定性，同时染色体若发生非整倍体分裂，则会被细胞纺锤体监控位点识别，使分裂停滞等［35］，进而影响4细胞胚胎以后阶段及囊胚阶段的发育。本研究结果显示，对比空泡精子与无空泡精子注射入卵后发现，后者在正常受精率和胚胎冷冻率上均显著高于空泡组，由于临床数据有限，仍然需要进一步的详细研究。

近年来，许多研究表明受精卵的中心体来自父源性遗传，精子中心体在精卵原核形成过程中起着非常重要的作用［36-40］。人类精子的中心体由中心粒和围绕在他们周围的高密度蛋白质-中心体基质组成，精子的中心粒分为近端中心粒和远端中心粒。精子只保留近端中心粒，当精子进入卵母细胞后，保留的近端中心粒吸引卵母细胞中的中心体基质，重新组成具有复制功能的中心体，随后在中心体蛋白和微管蛋白的参与下不断重组、改编，最终形成精星体，精星体牵引着两原核使他们靠近，最终使两配子染色体组融合，完成受精过程。随后中心体完成复制并移动到合子细胞核周围，参与后期有丝分裂纺锤体的形成［41,42］。精子中心体功能（精星体形成）是受精的关键，这一结论也得到了许多研究人员的认同［21,43］。接受ICSI治疗患者受精失败是由于精星体形成失败所致，该研究也证实了这点［44］。本研究结果显示，中心体形态不规则的精子注射入卵后，正常受精率有所下降，如C组的受精率仅为57.14%显著性低于其他两组，本实验中当中心体形态较好时（A组），无空泡组的与空泡组的受精率没有显著性差异。Yoshinmoto等［45］用不育患者的精子注入牛卵母细胞中来评估精子中心体功能，发现早期的胚胎卵裂及后期的种植、妊娠过程与中心体功能也密切相关。正常情况下胚胎进行对等分裂，当中心体功能异常时，胚胎发生不均等分裂, 可能有1或2个卵裂球无细胞核，最终可能导致胚胎早期发育的阻滞［42,43］，这也表明中心体功能对早期胚胎的分裂发育是不可缺少的重要因素。对于无空泡精子按照中心体形态分为A、B、C 3组［21］，结果显示三组在正常受精率、D3优胚率和胚胎冷冻率上均有显著性差异。因此研究结果提示我们，精子中段形态的变化会影响卵母细胞的受精以及胚胎发育，由此推测中心体形态可能与中心体结构功能相关。

本研究系统分析了精子空泡以及中心体形态对精卵受精及受精卵发育之间的关系，当患者的精液质量较差，精子畸形率较高时，可以考虑使用IMSI技术，在高倍放大镜（×6 000）下观察、挑选无空泡且中心体形态较好的精子进行显微注射，降低挑选到遗传物质状态异常精子的概率，从而提高此类患者的助孕结局。但样本量较少仍是本次研究中存在的主要问题，后续的实验过程中，我们仍然需要进一步扩大样本量，更好的验证精子空泡对胚胎发育的影响以及中心体形态与受精及卵裂的关系。

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（2016-03-15收稿）

Impact of the vacuoles and the shape of the spermmidpiece for ICSI on embryos development of patients undergoing ICSI＊

Meng Xiangqian1, Gong Yi2, Xiong Fu3, He Fei3, Quan Song2**, Liu Jing1**
1. Center for Reproductive Medicine, Chengdu Jingjiang Hospital for Maternal and Child Health Care, Chengdu 610066，China；2. Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Nanfang Hospital, Southern Medical University；3. Department of Medical Genetics,Nanfang Hospital, Southern Medical University,

Quan Song, E-mail:quansong@smu.edu.cn；Liu Jing, E-mail:liujing20060402@126.com

Objective To clarify if there are any vacuoles at the head of sperm using the motile sperm organelle morphology examination （MSOME） system , and evaluate whether the morphology of the sperm midpiece and the head vacuoles in fl uence further embryo development.MethodsSperms were obtained from 57 patients undergoing ICSI as a result of male infertility in the Center for Reproductive Medicine, Chengdu Jinjiang Hospital for Maternal and Child HealthCare. Normal morphology of sperms were selected under a magnification of ×200-×400 at first, then the selective sperms were observed under high magnification of 6000×. According to the shape of sperm medpiece ,there were three classes:（A class: 1≤a/b≤1.2；B class: a/b≥1.5；C class: other）. These sperms were divided into six groups based on the shape of the sperm midpiece and existing vacuoles under 6000 magnification.（vacuoles-A group: 1≤a/b≤1.2, there was at least one vacuole exist in the head of sperm；vacuoles-B group：a/b≥1.5 and there was at least one vacuole exist in the head of sperm；vacuoles-C group: other and there was at least one vacuole exist in the head of sperm；vacuole free-A group；vacuole free-B group；vacuole free-C group） at 6000 magnification. The oocytes of 57 ICSI couples were injected with spermatozoa of six groups.ResultsThere were no signif i cant differences between thevacuoles-A group, vacuolesThere were no statistically significant differences between the vacuoles-A group、vacuoles-B group、vacuoles-C group were observed with regard to rates of fertilization, D3 top quality embryo，blastocyst formation,cryopreservation （P＞0.05）. There were no statistically significant differences in rate of blastocyst formation （P＞0.05） between the vacuoles free-A group、vacuole free-B group、vacuole free-C group, the rates of fertilization（74.48 %VS 84.62 %VS 57.14% ）, cleavage（96.17%vs 97.06%vs80.95%）, D3 top quality embryo （35.48% vs 39.39 %vs 9.09%）, D6-blastocyst （21.05%vs34.78%vs0）, cryopreservation（31.25 %vs 26.92% vs 0） were statistically significant different （P＜0.05）. Furthermore, the rate of cryopreservation（14.63 %vs 31.25%）were statistically significant different（P＜0.05）between the vacuoles-A group and vacuoles free-A group. The rate of fertilization（57.14 %vs 84.62%）were statistically signif i cant different （P＜0.05） between the vacuoles-B group and vacuoles free-B group. The rates of blastocyst formation （40.0% vs 0）, cryopreservation （50.00% vs 0） were statistically signif i cant different （P＜0.05） between the vacuoles-C group and vacuoles free-C group. There were no statistically significant difference about other indexes in the three classes sperms.ConclusionA significant improvement in normal fertilization rate and D3 top quality embryo rate and cryopreservation rate was found through selecting sperms based on normal midpiece morphology and no vacuole. This preliminary result need to be further validated by enlarge the sample size

sperm injections, intracytoplasmic；spermatozoa；vacuoles；centrosome；embryonic development

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.06.002

R321-33

资助： 国家自然科学基金（81170575）；四川省科学厅基础医学研究项目（2012JY0066）；四川省医学科研青年创新课题（Q15056）

**通讯作者：全松, E-mail:quansong@smu.edu.cn；刘敬, E-mail:liujing20060402@126.com