陈　进

(潍坊工程职业学院 应用化学与生物工程学院，山东 青州　262500)



百合病毒检测技术研究进展

陈进

(潍坊工程职业学院 应用化学与生物工程学院，山东 青州262500)

摘要：百合病毒病是影响百合切花和种球产量与质量的关键问题之一。针对百合病毒检测技术的研究有利于及早发现感染百合植株的病毒，并及时采取相应措施。本文对目前较为常用的四种百合病毒检测方法进行了阐述，并对每种方法的优越性和局限性进行了介绍和对比，旨在为后续的病毒检测技术研究工作提供参考。

关键词：百合；病毒检测；研究进展

百合(Liliumspp.)为百合科百合属多年生球根花卉，由于其花姿雅致、寓意美好，深受广大消费者喜爱，是国际上重要的切花观赏花卉。但就我国目前的百合生产现状来看，整个产业缺乏特有品种，自主化程度较低，百合生产主要依靠国外进口种源。在不断的引种和扩繁过程中，由于有些种源质量不高，种球自繁不规范，使得百合体内的病毒不断积累。这些病毒主要对百合的鳞茎、叶片、花等构成危害，致使染病百合的茎秆、叶片或花出现畸形或斑驳，病情严重时导致植株矮小、退化甚至死亡，影响百合的正常生长，严重影响了我国百合的产量和质量[1]。由于百合病毒病具有较强的传播性，目前我国百合病毒病的发病率一般在40%-50%，二代种球的带病率更是达到90%以上，给我国的百合产业带来了巨大损失[2]。因此，为了及早发现染病植株，防止病毒的进一步传播和扩散，许多学者对百合病毒的检测技术进行了研究筛选，希望能找到一种便捷、快速、准确的病毒检测技术。

目前我们国内较为常用的病毒检测方法主要有四种，分别是指示植物法、电镜检测法、血清学方法和分子生物学技术。

1指示植物法

指示植物法是最早应用于植物病毒检测的方法之一。这种方法主要是利用受病毒侵染能产生明显症状的寄主植物进行病毒检测。染病植物的叶片经研磨后得到粗汁液，然后蘸取汁液摩擦指示植物的叶片，经清水清洗后，置于室温条件下观察是否有病症显示。根据检测病毒的不同，常用于百合病毒检测的指示植物有台湾百合、麝香百合、番茄、菜豆、郁金香等[3]。

当侵染植物的病毒具有可见的症状时，运用指示植物法可以直观地检测到待检植株中是否存在这种病毒，操作比较简单，但也存在很多不足。首先，检测周期很长，等指示植物表现出症状最短需时10-20d，长的则需要1-3个月；其次，灵敏度比较低；第三，受时间限制，由于植物生长会受到季节变化的影响，因此季节也是制约这种方法应用的因素之一。而有些病毒如烟草环斑病毒(TRSV)、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)和水仙花叶病毒(NMV)，侵染植物后并不表现症状，或者症状不明显，这种情况下不适合用指示植物法进行检测[4]。而且，指示植物园的建设、维护费用很高，也不利于指示植物法的推广应用。

2电镜检测法

电镜检测法也称电子显微技术，它主要包括四种方法，分别是超薄切片法、负染色法、免疫电镜法和胶体金法等。负染色法具有直接、简便、迅速的优点，因此被广泛地运用到百合病毒的检测和鉴定研究中。超薄切片法可以确定病毒在细胞中的存在状态，洪健等[5]在研究中运用超薄切片法判断百合中是否存在百合斑驳病毒(LMoV)，在他们的诊断中，将百合叶片细胞中有无风轮状、束状内含物作为重要依据。随着免疫技术的发展，免疫电镜技术(ISEM)诞生了，它是将电镜技术与免疫技术相融合从而产生的新技术。ISEM技术的优点在于，它不仅使检测的敏感性得到了很大的提高，而且可以准确地判定出病毒的种类。另外一种较为常用的电镜检测技术是胶体金法，它是以病毒样品与相应免疫球蛋白的特异反应为原理。杨佐琦等[6]的研究发现，利用蛋白A-胶体金法对百合无症病毒(LSV)进行检测，只需在低倍率的电镜下就可以观测到病毒的存在，检测效果远远优于免疫电镜法。

电镜检测法简便快捷，并且可以用于大量样品的检测。但是电镜技术往往需要较高的设备购置费用和样品制备费用，这些都使电镜检测技术的推广应用受到了一定的限制。

3血清学方法

血清学方法是目前国内外最为常用的一种百合病毒检测方法，具有特异性强，灵敏度高，结果易观察等优点。目前用于百合病毒检测的血清学方法主要有：酶联免疫吸附法(ELISA)、A蛋白夹心—酶联免疫吸附法(PAS-ELISA)、双抗体夹心—酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)、点免疫结合法(DIBA)、组织印迹法(TBIA)、伏安酶联免疫分析法等。

将酶的高效催化特性与抗原抗体的免疫反应相结合，就得到了酶联免疫吸附法。运用一定的化学方法，将抗体与酶相结合成酶标抗体[7]。酶标抗体可直接或间接与待测抗原或抗体特异性结合，从而检测病毒的存在。后人在ELISA方法的基础上又研究出了新的检测方法。Hawkes等[8]将酶标板替换为硝酸纤维素膜，建立了一种新的方法—DIBA法，使检测更为快速、简便、经济。

Niimi[9]在田间取样，利用ELISA和DIBA两种方法对所取样品进行了检测。结果发现，52.4%的被检样品中存在LSV，0.9%的样品中存在黄瓜花叶病毒(CMV)；2003年徐品三等[10]用ELISA方法对两个百合品种“卡萨布兰卡”和“魅力”的脱毒种球进行病毒检测，分别对CMV，LMoV和LSV三种病毒进行了检测。但是这两种方法的检测灵敏度都比较低，无法检测纳克(ng)水平以下的病毒。

PAS-ELISA是将病毒抗血清用葡萄球菌A蛋白进行包被，然后与抗原识别；DAS-ELISA是用另外一种病毒的抗体与抗原进行识别。DIBA将酶标板替换为硝酸纤维素膜，使病毒检测更为便捷、经济，便于在百合病毒大规模检测方面进行应用。组织印迹法(TBIA)是把感病组织做切块处理后直接固定在硝酸纤维膜上，再利用抗原与抗体反应的特异性对植物病毒进行检测，它是在点免疫结合法基础上进行改进得到的一种方法。在对LSV进行检测的试验中，组织印迹法的灵敏度比酶联免疫吸附法高30倍，组织印迹法与点免疫结合法相比，操作比较简单，且灵敏度较高，更适合在大量样品的检测中应用。Meissner[11]运用伏安酶联免疫分析法对烟草环斑病毒(TRSV)和烟草花叶病毒(TMV)进行检测，试验中用到的酶是联苯胺—H2O2—辣根过氧化物酶(HRP)，根据IgG—HRP与植物病毒及其抗血清的免疫反应，可以间接测定植物病毒。这种方法的灵敏度高于ELISA显色光度法，线性范围也比ELISA显色光度法要宽，且免疫特异性更强，是血清学检测法的一大进步。

血清学方法所用设备的购置费用较低、操作方法也较简单、结果准确，较前几种方法有很大的进步，但它也存在一定的问题。首先，并不是所有的植物病毒都具有外壳蛋白，有些病毒在特殊情况下外壳蛋白是缺失的；其次，类病毒是没有外壳蛋白的；第三，病毒并不是均匀地分布在被感染植株上的；最后，阳性样品与阴性样品的区分常会受到季节性变化的影响。这些都制约着这种方法在植物病毒检测中的应用。

4分子生物学技术

分子生物学技术将病毒检测灵敏度提高到了皮克级，相比血清学的纳克水平有了很大提高，用特异引物的PCR测定方法则更加灵敏。这种方法特异性强、适应范围广、检测速度快，应用对象可以是DNA病毒、RNA病毒和类病毒，并可用于大量样品的检测。目前常用的分子生物学技术包括双链RNA(dsRNA)电泳技术、核酸斑点杂交技术(NASH)以及反转录PCR(RT-PCR)技术。

双链RNA技术检测植物病毒的原理是分析植物组织中的双链RNA(dsRNA)。植物病毒的基因组约有90%为单链RNA(ssRNA)，当病毒侵入到植物体内后，会以ssRNA为模板合成出dsRNA，因此可以通过对植物组织中dsRNA的分析判断它是否被病毒侵染，并对侵染它的病毒进行诊断研究。

NASH技术是利用核苷酸探针对病毒进行检测的一种方法。利用互补核苷酸单链能够相互结合的原理，将病毒的一段核酸单链标记成探针对相应病原进行检测。现在这种检测技术已经成为植物病毒检测最常用的方法之一。

RT-PCR技术的检测灵敏性和特异性均优于免疫学方法，具有简便快速、特异灵敏等特点。云南农业大学应用DAS-ELISA，RT-PCR和IC-RT-PCR技术分别对LSV进行检测，结果表明：RT-PCR和IC-RT-PCR分别可从2ng和200ng的百合叶片组织中检测出LSV，其检测敏感度分别是DAS-ELISA的1000倍和10倍[12]。证实了RT-PCR技术的高度灵敏性。

RT-PCR技术在百合病毒检测方面的研究最早在国外展开。1991年Langeveld运用PCR技术成功完成了LMoV的检测。1996年Joung[13]利用RT-PCR技术检测到了百合中的LSV。Lee[14]利用RT-PCR技术对东方百合的CMV、LSV、LMoV三种病毒的发生情况进行了检测。2003年Niimi等[9]在检测侵染百合的LSV时，对ELISA和RT-PCR两种方法的检测灵敏度进行了比较，发现RT-PCR的检出率明显高于ELISA，在他们的试验中，成功利用RT-PCR方法检测了3个百合品种的CMV、LMoV和LSV病毒。

随着检测技术的发展，后续的研究人员在传统RT-PCR的基础上经过改进，发展出了多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR)技术。多重RT-PCR又被称为复合RT-PCR，曾有研究人员利用这种方法对6种植物病毒进行了同时检测，大大提高了病毒复合侵染情况下的诊断效率，并且也使试验成本得到了显著降低，在实际检测中具有很高的应用价值[15]。王继华等[1]应用多重RT-PCR技术对LSV和LMoV进行了检测，灵敏性测定结果表明，该双重PCR可从稀释104组织中检测出病毒，具有与单一PCR相同的灵敏性。黎昊雁等[16]利用多重RT-PCR方法对LSV、LMoV及百合x病毒进行了同步检测。徐榕雪等[17]建立了同时检测CMV、LMoV 和LSV的多重RT-PCR检测方法，扩增产物测序表明，这三种病毒的地域差异不明显，外壳蛋白序列高度保守。郑丽娜等[18]应用多重RT-PCR方法对5个百合品种的CMV、LMoV 和LSV病毒进行了同步检测，并指出应用多重RT-PCR每个样品的直接检测费用是单一RT-PCR的30%。陈进等[19]利用多重RT-PCR方法对新铁炮百合杂种系品种“雷山一号”(Liliumformolongi‘Raizan1’)的CMV、LSV 和LMoV三种病毒进行了同步检测，在引物设计、扩增条件筛选等方面进行了优化，提高了检测的准确性和效率。但上述研究都是根据PCR产物中病毒特异性条带的有无来判断植株是否带毒，这就导致了当反应体系中有抑制物时，或由于操作不当以及试剂失效等的情况下，有可能出现假阴性的情况，从而影响病毒的正常检出。

运用RT-PCR技术检测百合病毒的灵敏度较高，能够检测到飞克(fg) 数量级的植物病毒，并且这种方法没有放射性危险，比较安全可靠，还可以应用到大规模的病毒检测当中。因此，分子生物学技术，尤其是RT-PCR技术在百合病毒检测中的应用具有很高的研究价值和推广应用价值。

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(责任编辑：刘小林)

doi：10.3969/j.issn.1009-2080.2016.03.027

收稿日期：2016-04-08

作者简介：陈进(1988-)，女，山东青州人，潍坊工程职业学院应用化学与生物工程学院教师。

中图分类号：S685.99

文献标志码：A

文章编号：1009-2080(2016)03-0102-04