江雄波，陈益娴，张俊青，樊晓琳，闵水发，边银丙，范秀芝

（1．湖北生态职业技术学院，湖北 武汉 430200；2．华中农业大学应用真菌研究所，湖北 武汉 430070；3．湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北 武汉 430064）

氮源比例和耳场条件对黑木耳胶原蛋白含量的影响*

江雄波1，陈益娴1，张俊青2，樊晓琳2，闵水发1，边银丙2，范秀芝3**

（1．湖北生态职业技术学院，湖北 武汉 430200；2．华中农业大学应用真菌研究所，湖北 武汉 430070；3．湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北 武汉 430064）

在黑木耳代料栽培基本配方中，采用不同比例的麦麸、豆饼粉和玉米粉为氮源，同时选择露天水泥地、林下露地和林下荫棚3种出耳场所，测定不同培养料配方和出耳场地条件下黑木耳冬耳和春耳中胶原蛋白含量。结果表明，温度对黑木耳子实体中胶原蛋白合成具有促进作用，光照对胶原蛋白合成具有重要作用。不同氮源对子实体中胶原蛋白含量的影响存在差异，选择10%麦麸、10%豆饼粉为氮源进行林下露地栽培，春季的耳片中胶原蛋白含量最高。

黑木耳；氮源；出耳场地；胶原蛋白；羟脯氨酸

胶原蛋白（collagen）因其独特的生物相容、生物可降解、高拉伸强度、低免疫、止血以及促进细胞生长等功能，已被广泛应用于食品、化妆品、临床医学和化工原料等产品[1-5]。受疯牛病和口蹄疫等的影响，目前已有针对相对安全的黑木耳和榆耳胶原蛋白的研究[8-10]。

胶原蛋白广泛存在于动物的结缔组织及水产品加工副产物中[1]，其中猪和牛的皮、骨头，以及鱼皮、鱼骨、鱼鳞等都是胶原蛋白的主要来源[6-7]。黑木耳（Auricularia auricula-judae）又名木耳、云耳和光木耳，含有丰富的蛋白质、多糖、维生素等营养物质，是一种重要的食（药）用真菌。目前已从黑木耳中成功分离提取到胶原蛋白[8-9]，并比较了不同提取方法对胶原蛋白功能特性的影响[8]。本文主要研究培养料中不同氮源配比及出耳场所对黑木耳胶原蛋白含量的影响，寻找更适宜于黑木耳胶原蛋白合成的营养和环境条件，为利用黑木耳原料开发胶原蛋白产品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株为黑木耳单片5号，由华中农业大学应用真菌研究所提供。

1.2 主要试剂与仪器设备

羟脯氨酸标准品，上海源叶生物科技有限公司产品；胰蛋白酶，biosharp公司（酶活为250 U·mg-1）产品；TYSP-200型高速万能粉碎机，浙江省永康市红太阳机电有限公司；超微量紫外/可见分光光度计，美国DeNovix公司。

1.3 培养料中氮源种类及组成

黑木耳代料栽培培养料基本配方为：阔叶树杂木屑78%、麸皮20%、石膏1%、蔗糖1%。在基本配方中，设计6种替代20%麸皮作为氮源的配方，具体配方见表1。

表1 培养料配方Tab．1 Formulae of culture materials

原料混匀后调节含水量58%～62%，pH 6．0～6．5。采用聚乙烯塑料袋，大小15 cm×30 cm，按照常规方式进行制袋和接种[11]。试验于2014年9月～翌年3月在湖北省大冶市楚林林场进行。菌袋制作时间2014年9月1日，11月1日进行刺孔，平均每个菌袋刺孔130个，于2014年12月10日开始催芽。

1.4 催芽与出耳管理

在3种不同出耳场所进行催芽与出耳处理。处理I为在露天水泥地上进行催芽和出耳管理，即在水泥地面上摆放菌袋。处理II为在林下露地催芽出耳，将刺孔后的菌袋放置在桂花树、红叶石楠组成的阔叶林苗圃地表面，菌袋上不覆盖薄膜和稻草。处理III为林地荫棚催芽出耳，先在阔叶林木苗圃地表面铺1层稻草，将已刺孔的菌袋垂直摆放在稻草上面，菌袋之间相距2 cm～3 cm；在菌袋上方用竹片支起拱棚，拱棚高于菌袋5 cm～10 cm；覆盖薄膜，薄膜上再盖1层稻草；白天将稻草揭开，晚上再将稻草覆盖保温；每天中午12点～下午14点揭开薄膜，进行通风换气。

根据菌袋表面干湿度适当喷水，保持空气湿润。按照出耳时间，分别采摘冬季和春季长出的黑木耳子实体，晒干后获得冬耳和春耳产品。

1.5 黑木耳中胶原蛋白含量测定

1．5．1 黑木耳样品的处理

0．05 mol·L-1氯胺T溶液、3．15 mol·L-1过氯酸、10%对二甲氨基苯甲醛溶液、羟脯氨酸标准贮存液和应用液的配制参照文献[12]进行。

采摘不同编号的黑木耳子实体，用蒸馏水连续冲洗3次，30℃干燥烘干至恒重，分批粉碎后100目过筛。每个样品称量干重1．0 g，丙酮脱脂24 h，使丙酮挥发，冷却45 min，干燥至恒重后将样品溶解在（pH8）0．05 mol·L-1磷酸缓冲液中，加入8%（0．08 g）胰蛋白酶，使料液比为50∶1，酶解6 h，酶解结束后于12 000 r·min-1条件下离心15 min，吸取上清液10 mL，置于4℃冰箱里冷藏备用。

1．5．2 黑木耳中胶原蛋白含量测定

吸取上清液1 mL，加入0．05 mol·L-1氯胺T溶液氧化而形成吡咯环的氧化物，过氯酸终止氧化后用对二甲氨基苯甲醛作显色剂，生成红色化合物，在550 nm波长下进行比色测定。通过测定的羟脯氨酸含量计算得出胶原蛋白含量（C，%），计算公式为：

C=C1×V×N×X/M式中：C1表示羟脯氨酸的测定质量浓度；V表示上清液体积；N表示稀释液倍数；X表示换算系数，参照哺乳动物中系数值，采用换算系数是7．46[13]；M表示称重的黑木耳质量。

数据采用SPSS软件处理分析[14]。

2 结果与分析

2.1 不同氮源对黑木耳胶原蛋白含量的影响

不同氮源对黑木耳胶原蛋白含量的影响见图1。

由图1可见，配方A所得冬耳中胶原蛋白含量明显高于春耳，且在7个配方中，配方A（仅以豆饼粉为氮源）获得的冬耳胶原蛋白含量最高（0．74%）；配方B（麦麸10%、豆饼粉10%）春耳胶原蛋白含量最高（0．94%），且是所有配方中胶原蛋白含量最高的。除配方A外，其它培养料中生长冬耳和春耳，均为春耳中胶原蛋白含量显著高于冬耳。

图1 不同氮源配方对黑木耳胶原蛋白含量的影响Fig．1 Effects of different nitrogen sources on collagen content of A.auricula-judae

2.2 不同耳场条件对黑木耳胶原蛋白含量的影响

不同耳场条件对黑木耳胶原蛋白含量影响见图2。

图2 不同耳场条件对黑木耳胶原蛋白含量的影响Fig．2 Effects of different fruiting environment on collagen content of A.auricula-judae

由图2可见，不同栽培场所及管理方式下，所得胶原蛋白总量具有显著差异，即林下露地＞林下荫棚＞露天水泥地；不同栽培管理模式下，春耳中胶原蛋白含量显著高于冬耳，冬耳和春耳中胶原蛋白含量差异趋势相同；但在不同出耳场所及管理模式下，不同季节采摘的不同批次子实体中胶原蛋白含量差异无明显规律性。

3 结论与讨论

除配方A，6种氮源配方和3种耳场环境条件下所得春耳胶原蛋白含量显著高于冬耳，推测温度对胶原蛋白合成具有促进作用。

通过氮源配方试验，推测不同氮源对黑木耳中胶原蛋白的合成具有调控作用，其中20%豆饼粉对不同季节采摘耳片胶原蛋白含量的影响表现出不同趋势，推测可能与其培养料中较低碳氮比有关。在露天水泥地、林下露地和林下荫棚3种耳场环境条件中，黑木耳在出耳过程中所接受的光照强度存在差异，即光照强度依次降低，所得黑木耳子实体中胶原蛋白含量呈现先升高后下降的趋势，推测黑木耳胶原蛋白的合成还受光照调控，光照太强和太弱都会抑制胶原蛋白的合成。因此，通过本研究可知，为获得胶原蛋白含量较高的黑木耳子实体，可选择10%麦麸、10%豆饼粉为氮源，林下露地栽培，春季出耳。

综上，本研究通过不同培养基质的筛选和配套栽培管理措施的选择来提高营养或活性成分的含量，并为以黑木耳为原料生产胶原蛋白应用于食品、化妆品、医疗保健等领域奠定理论基础。

[1]万春燕，王英华，邬元娟，等．胶原蛋白在食品中的应用现状及其发展前景[J]．中国食物与营养，2008（9）：24-26．

[2]王昱琳．胶原蛋白在化妆品中的应用研究进展[J]．明胶科学与技术，2012，32（1）：8-12．

[3]顾其胜．胶原蛋白的临床应用[J]．中国修复重建外科杂志，2006，20（10）：1052-1056．

[4]王春侠．胶原蛋白在医疗保健领域的应用研究[J]．现代医药卫生，2011，27（23）：3588-3590．

[5]白海英，柯蕾芬，朱文赫，等．胶原蛋白应用的研究进展[J]．吉林医药学院学报，2013，34（2）：33-135．

[6]刘振锋，吕卫金，戴圣佳，等．胶原蛋白的提取、改性及应用研究进展[J]．食品与药品，2014，16（6）：443-447．

[7]Mahboob S．Isolation and characterization of collagen from fish waste material-skin,scales and fins of Catla catla and Cirrhinus mrigala[J]．Journal of Food Science and Technology, 2015,52(7):4296-4305

[8]郝文芳．黑木耳胶原蛋白提取及其功能特性的研究[D]．哈尔滨：东北林业大学，2008．

[9]刘静波，赵颂宁，林松毅，等．酶解法提取黑木耳中胶原蛋白的工艺优化[J]．农业工程学报，2012，28（13）：282-286．

[10]常桂英．榆耳胶原蛋白提取工艺研究[J]．江苏农业科学，2012，40（4）：69-271．

[11]吕作舟．食用菌栽培学[M]．北京：高等教育出版社，2005：161-176．

[12]张玉娥．肺组织胶原蛋白测定方法的探讨[J]．中兽医医药杂志，1997，4（5）：13-14．

[13]董宪兵，李侠，张春晖，等．分光光度法测定畜禽骨素中胶原蛋白含量 [J]．现代食品科技，2013，29（10）：2538-2541，2419．

[14]蒋明，何南．SPSS软件在农业统计分析中的应用[J]．计算机与农业，2001（11）：14-16．

Effects of Nitrogen Source and Fruiting Environment on Collagen Content of Auricularia auricula-judae

JIANG Xiong-bo1,CHEN Yi-xian1,ZHANG Jun-qing2,FAN Xiao-lin2, MIN Shui-fa1,BIAN Yin-bing2,FAN Xiu-zhi3
(1．Hubei Ecology Technical College,Wuhan 430200,China;2．Insistute of Applied Mycology,Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070,China;3．Institute of Agro-Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430064,China)

The collagen content of Auricularia auricula-judae picked at winner and spring,with different proportion of wheat bran,bean cake powder and corn flour as nitrogen sources and cultivated open or shed under the forest and open-air,were determined．The results showed that the temperature during the fruiting had a role promotion effect on collagen synthesis,and the light showed significant effect on the synthesis．The effect of nitrogen sources on collagen content was different．In this paper, using 10%wheat bran and 10%soybean meal as nitrogen source,open culture under forest,picking at spring,it can get fruiting bodies with highest collagen content．

Auricularia auricula-judae;nitrogen source;fruiting field;collagen;hydroxyproline

S646.9

A

1003-8310（2016）01-0050-03

10．13629/j．cnki．53-1054．2016．01．014

中央财政林业科技推广示范项目（HBTG02）。

江雄波（1975-），男，本科，高级工程师，主要从事林业经济作物栽培研究。E-mail:stxycyb＠163．com

**通信作者：范秀芝（1984-），女，博士，助理研究员，主要从事食用菌活性物质代谢调控及功能食品开发研究。E-mail:xzhfan＠aliyun．com

2015-11-15