施春煜

（郑州市第十一中学，河南郑州 450002）

牛奶中β-内酰胺酶半定量快速检测试纸的研究

施春煜

（郑州市第十一中学，河南郑州 450002）

青霉素经β-内酰胺酶分解得到的产物青霉噻唑酸具有还原性，与亚铜试剂发生络合反应生成紫红色络合物，在一定范围内络合物的颜色深浅与β-内酰胺酶的量呈线性关系。将醋酸纤维素膜（CA）作为显色层放在亚铜试剂（2.5%2,2'-联喹啉乙醇溶液与0.2 mol/L CuSO4溶液均匀混合）中浸泡10 min，进行显色反应，45℃下真空干燥30 min，制得β-内酰胺酶半定量快速检测试纸；配制β-内酰胺酶标准品溶液0～250 U/mL（0，6，12，25，50，100，150，200，250 U/mL），在显色层进行显色反应后，利用分光测色仪测定不同梯度下的颜色，得到L*值，a*值和b*值，并应用色彩模块软件进行模拟，按照β-内酰胺酶标准液的浓度梯度进行排列、粘贴，制成β-内酰胺酶标准比色卡。通过试验得出β-内酰胺酶在牛奶样品中最低检出限为6 U/mL，相对误差范围7.51%～15.38%。β-内酰胺酶半定量快速检测试纸具有快速、操作简单、经济实用、易于普及和现场测定的优点。

β-内酰胺酶；快速检测试纸；牛奶

革兰氏阳性菌分泌产生的β-内酰胺酶（βlactamase），具有可选择性酶解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素的能力，通过破坏7-氨基头孢烷酸（7-ACA）和6-氨基青霉烷酸（6-APA） 等结构，进而破坏抗生素并且使酶解后的物质进入奶制品中，酶联免疫法、微生物法等常规检测方法在检测中失效，从而常规方法无法准确检测出是否含有抗生素，掩盖抗生素超标的事实[1-2]。在碱性条件下，β-内酰胺酶与青霉素发生反应，亲核性基团向青霉素内的β-内酰胺环进攻，破坏7-氨基头孢烷酸（7-ACA）和6-氨基青霉烷酸（6-APA）等结构，β-内酰胺环开环后脱羧重排形成中间体青霉噻唑 酸[3-4]。实际生产中，有些微生物虽然可以产生β-内酰胺酶，但由于牛奶组分、采奶方式、灭菌方法、包装方法和储存条件的影响，使产β-内酰胺酶的微生物无法生存，只有在人为条件下添加β-内酰胺酶才能够检测到微生物分泌的β-内酰胺酶[5]。因中间产物青霉噻唑酸具备将二价铜离子还原为一价铜离子的还原性。在Baker WL的报告中[6]，在2,9-二甲基-1,10-菲啰啉、2,2'-联喹啉与一价铜的反应中，前者的反应环境要求pH值为3.2～6.5，生成黄色络合物，于波长460 nm处有最大吸收峰；后者的反应环境要求pH值为3.5～7.0，生成紫红色络合物，于波长520 nm处有最大吸收峰。牛奶的颜色为乳白色，pH值为6.8，在2,2'-联喹啉反应环境之间，且肉眼容易观察到牛奶中出现紫红色的颜色变化，故在2,9-二甲基-1,10-菲啰啉试剂与2,2'-联喹啉试剂的选择中，选择2,2'-联喹啉作为显色剂，故以双光束紫外-可见分光光度法为基础，建立一种快速、操作简单、经济实用、易于普及和现场测定的乳制品中β-内酰胺酶半定量快速检测方法。

2 材料与方法

2.1 试验材料

标准品β-内酰胺酶、标准品青霉素钾，购自中国药品生物制品检定所；2,2'-联喹啉，购自上海晶纯试剂有限公司；三氯乙酸（TCA）、硫酸铜、冰醋酸，均为分析纯，购自洛阳市化学试剂厂。

2.2 试验仪器

UV-6100型双光束紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限责任公司产品；DZF-6090型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司产品；SMY-2000型全自动测色色差仪，北京盛名扬科技开发有限责任公司产品；AUY220型电子天平，日本岛津公司产品。

2.3 试验方法

2.3.1 检测试纸的制备

亚铜试剂的配制：0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%的2,2'-联喹啉乙醇溶液（B）；0.05，0.1，0.2，0.3，0.4 mol/L CuSO4的硫酸铜溶液（C），将B液和C液进行梯度混合均匀后即得显色液。将显色层醋酸纤维素膜浸入上述显色液中，显色反应10 min后，置于玻璃板上真空干燥箱中45℃下干燥30 min，制成显色层，裁剪成10 cm×1.0 cm，将过滤层、显色层和吸收材料层粘贴在基板上，得到β-内酰胺酶半定量快速检测试纸。

2.3.2 β-内酰胺酶标准比色卡的制备

（1）配制9份浓度为5 000 U/mL的青霉素底物溶液，分别加入浓度为0，6，12，25，50，100，150，200，250 U/mL β-内酰胺酶标准溶液，混合均匀后于37℃下水浴60 min。

（2）取出后加入5 mL添加15%TCA，以转速4 000 r/min离心10 min，取上清液100 μL，然后将上述制备β-内酰胺酶半定量快速检测试纸浸入上清液5～10 min后取出，进行显色反应。

（3）使用测色仪测定颜色反应的L*值，a*值和b*值，并利用计算机中的色彩模块软件对颜色反应的数值进行模拟，制作标准比色块。按照β-内酰胺酶标准液的浓度梯度进行排列、粘贴，制成β-内酰胺酶标准比色卡。

2.3.3 实际最低检出限和精确度

（1）试纸实际最低检出限。用市售牛奶配制含有0，4，6，12，25，50，100，150，200 U/mL β-内酰胺酶，青霉素钾底物浓度皆为5 000 U/mL的 9个样品，于37℃下水浴1 h，按1∶1比例添加15%的TCA溶液，倒入离心管，混合均匀，放入离心机，以转速4 000 r/min离心10 min，取上清液，制备出不同浓度的待测样品。取β-内酰胺酶测定试纸，浸入待测样品溶液10 min，取出后与标准比色卡对照，即得到β-内酰胺酶的最低检测限[7]。

（2）试纸检测的准确度。配置β-内酰胺酶浓度梯度溶液，0，4，6，12，25，50，100，150，200 U/mL，在试纸显色层上做显色反应，观察显色结果，与分光光度法进行对比，计算相对误差表示准确度[8]。

3 结果与讨论

3.1 亚铜试剂的浓度对试纸显色的影响

样品添加量0.2 mL，底物浓度50 000 U/mL，反应时间10 min，随着亚铜试剂的浓度逐步升高，试纸显色紫红色逐渐变浅，其中2.5%2,2'-联喹啉乙醇溶液和0.2 mol/L CuSO4的硫酸铜溶混合组成的亚铜试剂，试纸显色为深紫红色。

亚铜试剂的浓度对试纸显色的影响见图1。

图1 亚铜试剂的浓度对试纸显色的影响

3.2 标准比色卡的制备

取2.3.2中9个发生颜色反应的试纸，使用分光测色仪测定试纸L*值，a*值和b*值等颜色反应数值，利用计算机中颜色模块软件对颜色反应的数值进行模拟后制作标准比色块。制作β-内酰胺酶的标准比色卡，可以看出颜色梯度的变化，随着β-内酰胺酶浓度增加红色渐渐加深。

β-内酰胺酶标准比色卡见图2，色卡的L*值、a*值、b*值见表1。

3.3 最低检出限

将β-内酰胺酶测定试纸浸在待测牛奶样品中5 min后取出与标准比色卡比照。由表2可知，当牛奶中β-内酰胺酶的浓度达到6 U/mL时，5 min内试纸就出现很浅的淡粉色，而低于6 U/mL时没有出现显色反应，即得出试纸对牛奶中β-内酰胺酶的最低检出限为6 U/mL。

图2 β-内酰胺酶标准比色卡

表2 试纸检出限的确定

表3 β-内酰胺酶试纸准确度

试纸检出限的确定见表2。 9个色块，分别对应β-内酰胺酶的9个浓度：0，6，12，25，50，100，150，200，250 U/mL，颜色从浅粉色渐变至深紫色，色阶梯度明显；检测试纸检测最低检出限为6 U/mL，相对误差范围为7.51%～15.38%。

3.4 试纸检测方法的精确度

β-内酰胺酶试纸准确度见表3。

由表3可知试纸检测与的准确度范围为7.51%～15.38%。

4 结论

检测试纸的制备条件为醋酸纤维素膜（CA）为载体制备显色层，在亚铜试剂（0.2 mol/L CuSO4溶液和2.5%2,2'-联喹啉乙醇溶液）中浸泡10 min进行显色反应，于45℃下真空干燥30 min，制备出β-内酰胺酶半定量快速检测试纸；标准比色卡含有

[1]崔生辉，李景云，马越，等.“生鲜牛乳抗生素分解剂”的鉴定与检测 [J].中国食品卫生杂志，2007，19（2）：113-116.

[2]郑颖，王震，范泉水，等.TEM-116型超广谱β-内酰胺酶对牛奶中抗生素的清除 [J].中国抗生素杂志，2008，33（2）：122-124.

[3]赵静玫，都绛瑛.青霉素裂解液的高效液相色谱分析[J].色谱，2001，19（1）：88-89.

[4]郑岩，王英武，周慧，等.电喷雾四级杆飞行时间质谱法在分析青霉素类药物负离子裂解规律中的应用 [J].分析化学研究简报，2004，32（2）：183-184.

[5]黄晓蓉，于竸，郑晶，等.牛奶中β-内酰胺类抗生素残留的快速检测方法 [J].中国乳品工业，2004，32（2）：44-47.

[6]Baker W L，唐建国，译.在中性pH值及室温下用二唆琳甲酸盐分析β-内酞胺酶 [J].国外医药抗生素，1990，11（3）：181-182.

[7]孙秀兰，杨婷婷，张银志.粮食中百草枯残留的金标免疫层析检测方法研究 [J].分析测试学报，2010，29（5）：507-510.◇

Study on the Semi-quantitative Rapid Test Strip of β-lactamase in Milk

SHI Chunyu
（Zhengzhou No.11 High School，Zhengzhou，He'nan 450002，China）

Penicilloic acid，the decomposer of penicillin G potassium by β-lactamase has the reducibility.The 2,2'-biquinolyl can coupling with Cu+to display purple，which the color depth and the amount of β-lactamase are in linearly within a certain range.The cellulose acetate membrane is used as colourably layer and immersed cuprous reagent of 2.5%2,2'-biquinolyl，0.2 mol/L of CuSO4for 10 min color reaction.The semi-quantitative rapid test for β-lactamase is prepared after vacuum drying for 30 min.The β-lactamase standard solution for gradient concentration 0～250 U/mL（0，6，12，25，50，100，150，200，250 U/mL） for colour reaction is prepared，using spectro-colorimeter to determine the color reaction L*，a*，b*value data，and application the color module software on its for simulation to prepare the standard color card.The detection limit of kit is 6 U/mL and relative error is 7.51%～15.38%.The β-lactamase kit method is rapid，simple，economical and practical，easy to spread and site.

β-lactamase；rapid test strip；milk

TS252.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.12.003

1671-9646（2016）12a-0011-03

2016-11-05

施春煜（1998— ），男，在读学生，研究方向为生物化学及生物技术。