朱红林， 徐 靖， 陈健晓， 王效宁

(海南省农业科学院 粮食作物研究所， 农业部作物基因资源与种质创制海南科学观测试验站， 海南省农作物遗传育种重点实验室， 海南 海口 571100)

芦笋全雄试管苗的繁育技术

朱红林， 徐 靖， 陈健晓， 王效宁*

(海南省农业科学院 粮食作物研究所， 农业部作物基因资源与种质创制海南科学观测试验站， 海南省农作物遗传育种重点实验室， 海南 海口 571100)

为给芦笋全雄试管苗的规模化生产提供可靠的技术途径，以大田芦笋茎段为外植体，采用组织培养的方法，研究建立芦笋全雄试管苗繁育技术。结果表明：0.1%升汞溶液消毒8 min最佳，外植体污染率为0，成活率达100%；以MS为基本培养基，6-BA浓度为0.4 mg/L时，外植体芽诱导率最高，达100%；6-BA和NAA配合使用，继代增殖最佳，繁殖周期为30 d，增殖系数为5.88；以1/2MS为基本培养基，添加1.0 mg/L IBA、0.1 mg/L NAA、1.0 mg/L PP333和15 mg/L Spm时，生根率为86.67%，根多、长、粗壮，且有须根，利于炼苗移栽成活。

芦笋； 全雄； 试管苗； 繁育技术

芦笋(Asparagusofficinalis)属百合科天门冬属多年生草本宿根植物，又称石刁柏、龙须菜，是一种低热量高营养的保健蔬菜，被誉为世界十大名菜之一，享有蔬菜之王的美称，同时其又对高血压、心脏病、癌症有特殊的疗效[1-2]。由于其食用和药用价值俱佳，在欧美各国、日本、东南亚等国际市场中已成为不可替代的高级营养蔬菜和保健食品，市场需求日益增加，供不应求[3]。芦笋雌雄异株，在一般情况下(常规种大田内)，雌雄株各占1/2，而雄株产量一般比雌株产量高20%～30%，但芦笋种子生产困难，成本高，芦笋种苗的缺乏限制我国芦笋产业的发展[4]。近年来，国内外学者在芦笋组织培养方面进行了诸多研究，并取得了较大发展，但芦笋组培试管苗生根难、生根率不稳定和移栽成活率低仍是芦笋试管苗实现产业化生产的制约因素[5-7]，仍需进一步研究。因此，笔者拟在前人研究的基础上，通过生根培养基中加入多效唑(PP333)和精胺(Spm)，探索建立高效的芦笋全雄试管苗高效快繁技术，以期解决芦笋优质种苗缺乏问题，为芦笋产业发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

20株格雷斯绿芦笋雄株由东方光华现代农业开发有限公司提供。

1.2 外植体消毒及接种

于晴天午后，选取20～25 cm茎，取其顶上约15 cm段。在超净工作台上用75%酒精消毒30 s，选用1%NaClO溶液振荡浸泡消毒时间设为10 min、13 min、15 min和17 min 4个处理；用0.1% HgCl2溶液振荡浸泡消毒，时间设为6 min、8 min、10 min和12 min 4个处理，无菌水冲洗5遍。将消毒的外植体切成约1.5～2.0 cm长的单节茎段，接种到诱导培养基中(图示A)，15 d后，统计污染率和存活率。

污染率=(污染外植体数/接种外植体总数)×100%。

存活率=(存活的外植体数/接种的外植体总数)×100%

1.3 培养条件的设计

1.3.1 诱导培养 以MS为基本培养基，分别添加6-BA 0、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L和1.5 mg/L 5个浓度水平，每瓶接种4 个外植体，每处理接种10瓶。接种30 d后统计茎段芽诱导率，其间观察诱导出芽的生长状况(图示B)。

1.3.2 继代增殖培养 经诱导长出的嫩茎新梢切成单节茎段，接种到以MS为基本培养基、分别添加不同浓度6-BA(0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L和0.6 mg/L)和NAA(0、0.05 mg/L、0.1 mg/L和0.2 mg/L)的培养基中，共16个处理，每个处理5瓶，每瓶5个单节茎段，培养30 d后记录生长情况，并统计诱导产生丛生芽数，计算繁殖系数(图示C)。

1.3.3 生根培养 切取增殖培养所得芽顶部长约1 cm(图示D)，转接到生根培养基上。生根培养基的确定分两步：第一步，以1/2MS为基本培养基，设计3因素4水平的正交试验：IBA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5mg/L和2.0 mg/L)、KT(0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L和0.5 mg/L)、PP333(0、1.0 mg/L、2.0 mg/L和3.0 mg/L)，共16个处理，每个处理15瓶，每瓶3株，观察记录根生长情况，30 d后统计生根率，确定IBA、KT、PP333的最佳组合浓度；第二步，第一步中确定的最佳组合浓度培养基中分别添加Spm 0、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L和20 mg/L 5个浓度水平，每个处理15瓶，每瓶3株，观察记录开始生根天数及根生长情况，30 d后统计生根率(图示E)。

1.3.4 共同培养条件 诱导培养和增殖培养基中添加白砂糖30 g/L，生根培养基中加白砂糖20 g/L，卡拉胶均为6.0 g/L，培养基pH 5.8。培养温度(28±1)℃，光照10 h/d，光照强度为2 000 lx以上。

注：A为外植体，B为外植体诱导出芽，C为茎段增值丛生芽，D为生根培养，E为组培苗生根。

Note: A, explants; B, buds induced from explants; C, multiple shoot from stem segments; D, rooting culture; E, rooting of tissue culture seedling.

图示 笋全雄试管苗繁育植株形态

Fig. Plant morphology bred by all-male tube seedlings ofA.officinalis

1.4 数据处理

用Excel 2007 数据分析库进行数据统计、方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂各消毒时间对芦荟全雄试管苗的消毒效果

不同的消毒剂和消毒时间对外植体消毒效果有较大的差别，同一种消毒剂，随着消毒时间的延长污染率降低，但对外植体的损伤越大(表1)。短时间内，0.1%HgCl2溶液的消毒效果比1%NaCIO溶液的消毒效果好。但0.1%HgCl2溶液对幼嫩茎段的损伤较大，茎尖长约3 cm的幼嫩茎段在用0.1%HgCl2溶液消毒8 min时，存活率≤20%。减少0.1%HgCl2溶液的消毒时间至6 min，茎尖和茎段出现严重污染。综合考虑污染率和存活率，外植体的最佳取材为茎尖3 cm以下长约12 cm的茎段，最佳消毒方案为0.1%HgCl2溶液消毒8 min，存活率达100%。

2.2 不同浓度6-BA 处理芦笋全雄试管苗的芽生长情况

从表2看出，接种培养7 d后，外植体在诱导培养基上直接从茎节处分化出芽点。6-BA 对芦笋茎段芽诱导影响较大，当培养基中不加6-BA时，芽诱导率仅为7.5%；而当6-BA浓度为0.4 mg/L时，外植体100%诱导出芽，芽生长快而粗壮；6-BA浓度继续升高，芽诱导率反而下降，出现黄化、玻璃花芽；当6-BA浓度达1.5 mg/L时，只有愈伤组织，不分化芽。

表1 不同消毒剂各消毒时间对芦笋全雄试管苗的消毒效果

表2 不同浓度6-BA 处理芦笋全雄试管苗芽的生长情况

2.3 不同激素组合处理芦笋全雄试管苗根与芽的增殖

2.3.1 根诱导 由表3数据经方差分析，IBA、KT和PP3333个因子对芦笋茎尖根诱导的影响均达显著水平，其中IBA影响作用大于KT和PP333，三者的相互作用对根诱导的影响显著，适宜的配比，根诱导的效果最好。经多重比较，IBA 1.0 mg/L与0.5 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L差异显著，当IBA浓度为1.0 mg/L 时，NAA 0.1 mg/L与0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L的差异也达显著水平，当IBA浓度为1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L时，PP3331.0 mg/L与0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L的差异也达显著水平。IBA1.0 mg/L与NAA 0.10 mg/L、PP3331.0 mg/L三者配合，根诱导率最大，根系生长状况也最好。

表3 不同激素组合处理芦笋全雄试管苗根的分化情况

注:同列中不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)(下同)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicated 5% significant level. The same below.

2.3.2 牙增殖 从表4可看出，单节茎段在16种激素组合处理中的增殖系数差异显著，最高达5.88，最低只有0.2。6-BA浓度低于或高于0.4 mg/L时，丛生芽增殖系数都较低，差异显著。说明，较低和较高浓度的6-BA对丛生芽的增殖效果均不理想。经对各处理的增殖系数进行方差分析，6-BA和NAA对丛生芽增殖的影响均达显著差异水平，其中6-BA对丛生芽的诱导影响作用大于NAA；6-BA和NAA的相互作用对丛生芽增殖的影响达显著差异水平，两者适宜的配比，丛生芽的增殖效果最好。经多重比较，6-BA 0.4 mg/L与0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.6 mg/L差异显著，当6-BA浓度为0.4 mg/L 时，NAA 0.1 mg/L与0、0.05 mg/L、0.20 mg/L的差异也达显著水平，6-BA 0.4 mg/L与NAA 0.10 mg/L两者配合，丛生芽的增殖系数最大，生长状况也最好。

表4 不同激素组合处理芦笋全雄试管苗的芽增殖情况

2.4 不同浓度精胺(Spm)处理芦笋全雄试管苗的根生长情况

从表5可看出，在5种不同处理中，试管苗在株高上无显著性差异，根诱导率、根数量、根长度和根平均直径均存在差异显著。随着Spm浓度的升高，根诱导率呈先上升后下降趋势，Spm浓度为15 mg/L时，根诱导率最高，达80.67%。同时，根数量最多、最长、最粗壮，且有须根，根质最佳，利于炼苗移栽。

表5 不同Spm 浓度处理芦笋全雄试管苗的根分化情况

3 结论与讨论

1) 建立了芦笋全雄试管苗高效繁育技术。于晴天午后，剪取雄芦笋植株茎段作外植体，用0.1%升汞溶液消毒8 min，接种于培养基MS+ 6-BA0.4 mg/L +白糖30 g/L +卡拉胶6.0 g/L(pH 5.8)中诱导，再将诱导的芽切割成单节茎段置于培养基MS+6-BA 0.4 mg/L +NAA 0.1 mg/L +30 g/L白糖+6.0 g/L卡拉胶(pH 5.8)中继代增殖，30 d后，切取增殖培养所得芽顶部约1 cm长，转接到生根培养基1/2MS+IBA1.0 mg/L + NAA0.1 mg/L + PP3331.0 mg/L + Spm 15 mg/L+白糖20 g/L +卡拉胶6.0 g/L(pH=5.8)中(其余茎段置于增殖培养基培养)。外植体芽诱导率为100%，继代增殖繁殖周期为30 d，增殖系数平均5.88，生根率86.67%。

2) 多效唑(PP333)是一种植物生长延缓剂，能控长矮化，提高叶绿素含量，增强植物抗逆性。PP333主要是通过阻碍贝壳杉烯向异贝壳杉烯酸的氧化，抑制赤霉素的生物合成发挥生理效应[8]。在植物组织培养中，适当浓度的多效唑均有利于植物愈伤组织的诱导、芽增殖、壮苗和生根等方面[9]。本研究结果显示，1.0 mg/L PP333有利于提高芦笋组培苗的生根率，改善根质，并促使壮苗。

精胺(spermine, Spm )是一种普遍存在于植物体内，对植物生长发育有广泛影响的多胺类化合物，许多研究表明，精胺对促进植物细胞分化、加速茎(芽)和根的生长有重要作用[10]。杨洪强等[11]研究证实，外源Spm可增加苹果幼苗新根数量；Hummel等[12]研究发现，甘蓝根系中内源Spm含量在0.1 μmol/L时，对根的长度影响最大；邹英宁等[13]研究发现，Spm浓度为1 mmol/L时有利于金柑组培苗植株生长和根系生长。本研究结果表明，生根培养基中加入15 mg/L Spm，可促进芦笋组培苗发根早、根多粗壮，且有须根，利于炼苗移栽。Spm促进植株生长和根系的形态可能与其提高植物组织内碳水化合物的含量关系密切，但其关系还有待进一步深入研究。

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(责任编辑： 刘忠丽)

Propagation Technique of All-male Tissue Culture ofAsparagusofficinalis

ZHU Honglin, XU Jing, CHEN Jianxiao, WANG Xiaoning*

(CerealCropResearchInstitute,HainanAcademyofAgriculturalSciences/ScientificObservationstationofHainanforCropGeneResourcesandGermplasmInnovation,MinistryofAgriculture,Haikou,Hainan571100,China)

To offer a credible way for seedling mass production of all-maleA.officinalis, stem segments from fieldA.officinaliswere cultured to establish a rapid propagation technique system. Results:0.1% HgCl2solution for eight minutes made a good effect, the contamination rate was 0, the survival rate was 100%; When the 6-BA concentration was 0.4 mg/L, in the MS basic culture medium, the rate of bud induction was the highest, 100%; 6-BA combined with NAA made a good subculture multiplication, the reproductive cycle was 30 days, and the proliferation coefficient was 5.88. When 1.0 mg/L IBA, 0.1 mg/L NAA, 1.0 mg/L PP333and 15 mg/L Spm were added to the 1/2MS basic culture medium, the rooting rate was 86.67%, and roots were the longest and thickest with fibrous roots, which was suitable for transplanting of plantlets.

Asparagusofficinalis; all-male; tube seedling; propagation technique

2015-08-31； 2016-03-27修回

海南省自然科学基金项目“芦笋全雄试管苗高效繁育技术研究”(314153)

朱红林(1973-)，女，助理研究员，硕士，从事植物组织培养研究。E-mail:714420368@qq.com

*通讯作者：王效宁(1973-)，男，研究员，硕士，从事作物遗传育种研究。E-mail:13368939015@163.com

1001-3601(2016)04-0151-0024-04

S644.6

A