MicroRNA在阿尔茨海默病中的作用及机制

田金鑫邵水金国海东

(上海中医药大学基础医学院解剖教研室,上海201203)

关键词〔〕阿尔茨海默病；微RNA；β淀粉样蛋白

第一作者：田金鑫(1989-)，女，硕士，主要从事电针治疗阿尔茨海默病的研究。

微RNA(miRNA)是真核生物中广泛存在的非编码RNA，长约21到23个核苷酸，预测转录后调节至少一半的人类转录组〔1〕。近年来发现，miRNA可能在阿尔茨海默病(AD)等神经退行性疾病的发生发展中发挥重要的调控作用。了解和探讨miRNA在AD中的作用及其机制可为临床寻找特异性的治疗靶点提供基础。

1miRNA的生物学基础

miRNA的生物合成途径是高度保守的，每个miRNA的调控靶点大约200个，而一个 mRNA的转录可能受多个miRNA调节。许多miRNAs通过转录因子或表观遗传机制，包括DNA甲基化和组蛋白修饰，受到高度时间和空间上的调节〔2〕。

1.1miRNA的生物合成大部分miRNAs是通过经典的miRNA生物合成途径产生的。首先，miRNA基因由RNA聚合酶(pol)Ⅱ转录，产生长约几千个碱基的初级转录产物(pri-miRNA)。pri miRNAs具有5'端帽和3'端多聚腺苷酸。他们可能编码一个单一的miRNA，独特的miRNA簇，或者蛋白质，因此也可以作为前体miRNA〔3〕。下一步，也发生在细胞核内，由微处理器复合物的精密调控。此复合物的主要成分是RNA聚合酶Ⅲ(Drosha)和其结合配偶体DiGeorge氏综合征关键区基因8 (DGCR8)，双链RNA结合蛋白〔4〕。Drosha剪切pri-miRNAs释放60～70个核苷酸长度的发夹结构，称为前体miRNAs(pre-miRNA)。Exportin-5介导pre-miRNA将其从核内运输到胞质中。在胞质中，第二个核糖核酸酶Ⅲ(Dicer)，切割pre-miRNA生成22个核苷酸的双链miRNA。miRNA双链与结合Argonaute(Ago)蛋白结合而迅速解链，一股成为成熟的miRNA，并结合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)上，通过降解靶mRNAs或阻遏转录参与mRNA表达的调控，见图1。而互补链在细胞内的浓度较低，被认为不具有功能，并且可被迅速降解。然而，最近的研究表明，一些互补链序列与不同的Ago蛋白复合物结合后也具有活性〔5〕。

图1　经典的miRNA生物合成途径

miRNA的产生还包括其他非经典的途径，在哺乳动物已被确定有四条不依赖于Drosha的途径，包括mirtron途径、小核仁RNA、tRNA和短发夹RNA来源途径〔6〕。在这些途径中，pri-miRNAs被剪接形成短发夹状内含子，被称为mirtrons，然后再被Exportin-5转运和Dicer剪切〔7〕。mirtrons在灵长类动物的神经系统中发挥重要作用〔8〕。此外，还有两条不依赖于Dicer的miRNA合成途径〔9〕。

1.2miRNA的再循环一般认为，miRNA半衰期长，是一种高度稳定的分子〔10〕。核酸外切酶在miRNA降解和再循环中可能发挥重要作用。研究表明，在动物体内，核酸外切酶(XRN)2可调控miRNA的衰退〔11〕。最近的研究证实，对于不同的miRNA和不同的类型细胞，miRNA的再循环差异很大，对神经元来说，其miRNA具有快速衰退的特征〔12〕。miRNA再循环可能有助于解释其调节大量的翻译的能力〔13〕。成熟的miRNA通过结合到Ago从而受到保护，而mRNA靶序列的存在被认为是在防止miRNA从RISC复合物释放以及随后降解的重要保护因素。因此，当mRNA靶序列不存在时，miRNA可被特异性释放，使RISC可结合新的miRNA。

1.3miRNA的作用机制目前认为，miRNAs通过抑制mRNA翻译或降解mRNA来调节基因表达。一旦掺入到RISC后，成熟miRNA通常在3'UTR区，通过碱基配对与靶mRNA转录识别。miRNA的2～6个核苷酸是目标识别的关键。miRNA及其靶mRNA序列之间互补的程度影响下游调控机制，精确的匹配可导致降解，而错配将导致翻译抑制。关于翻译抑制的确切机制仍不清楚，目前有一些相关的假说模型，包括抑制翻译起始、促进靶mRNA脱腺苷化、将miRNA及其靶点封存到P小体或应激颗粒或翻译后RISC介导的蛋白降解〔14〕。miRNA与靶点相互作用可使蛋白水平降低1/2〔15〕。虽然miRNA被认为主要是负性调控基因表达，但在细胞应激等情况下miRNA也可以激活其作用靶点。

2与AD相关的miRNA

AD是一种复杂的神经退行性疾病，是老年痴呆症的的最常见形式〔16〕。它起病隐匿，表现为缓慢的，渐进性的，并且不可逆的认知和记忆功能丧失，由于神经元和突触的破坏，最终将导致痴呆和死亡。AD的主要病理特征包括淀粉样蛋白-β(Aβ)沉积形成的老年斑、神经纤维缠结及胆碱能神经元及其突触的丧失。关于AD的发病机制中，以Aβ级联学说占主导地位。Aβ主要是一种40～42个 氨基酸片段，由其淀粉样前体蛋白(APP)经APPβ位点裂解酶(BACE1)和γ-分泌酶依次裂解后生成。除了Aβ级联学说外，还包括基因突变学说、胆碱能学说、免疫与炎症学说和氧化应激学说等。

miRNA在神经系统中表达十分丰富，在轴突生长，树突棘形成，神经元分化和突触可塑性等过程中发挥关键调节作用。最近的研究表明，miRNAs网络的改变将影响疾病的进程。AD患者脑组织中存在miRNA失调〔17〕。这些疾病相关miRNA的变化主要位于灰质区〔18〕。目前，已发现多种miRNA与AD关键基因调控变化有关，包括miR-106、miR-107、miR-132、miR-146、miR-153、miR-29和miR-9等。

2.1miR-106APP是miRNA调控的靶点之一。miR-106a和miR-106b可直接和APP mRNA结合，它们在AD患者前颞叶皮层表达下调〔19〕。有趣的是，miR-106能够调节ATP-结合转运体A1(ABCA1)，一种与ApoE脂化和生产Aβ的脂质转运体，这表明miR-106的可以不止通过一条途径影响Aβ的生成〔20〕。

2.2miR-107在AD的早期阶段，颞叶皮层miR-107下调，并与BACE1上调有关，这可能影响Aβ的产生〔21〕。而miR-107的减少将进一步伴随着神经炎斑块密度的升高〔22〕。有趣的是，miR-107和miR-124a除了BACE1之外还能调节APP代谢的其他方面，从而表明单一miRNA可影响同一条通路上多个靶点的能力，并可产生累加效应的潜力。MiR-107可直接靶向加工APP的另一个分泌酶整合素和金属蛋白酶10(ADAM10)，miR-124a通过直接靶向聚嘧啶结合蛋白1(PTBP1)参与APP mRNA选择性剪接。

2.3miR-132研究表明，AD患者中miR-132表达异常。miR-132可介导Akt生存信号通路、抗炎通路和乙酰胆碱代谢〔23〕。在细胞培养模型，下调miR-132的水平可导致神经元死亡〔24〕，并且AD和亨廷顿病(HD)的患者组织中miR-132的表达减少〔25〕。

2.4miR-146miR-146a是AD与炎症有关的一种miRNA，它可以调控先天免疫。在受AD病理影响的大脑区域，包括海马和颞叶皮层，miR-146a表达上调；而在未受影响的区域miR-146a水平保持不变〔26〕。研究表明，miR-146a的作用靶点包括补体因子(CF)H，白细胞介素(IL)-1受体相关激酶1(IRAK1)和肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6，这些都与AD失调的先天免疫和炎症通路有关〔27〕。miR-146a还可作用于跨膜四旋(TSPAN)12，TSPAN12是ADAM10的关键调节因子，因此miR-146a可能会影响Aβ的代谢〔28〕。这些发现进一步证明miRNA能够影响多种通路并介导发病机制之间的串话。

2.5miR-153在APPswe/PSΔE9双突变小鼠模型疾病的早期和晚期miR-153水平显著下降。与缺少新皮层神经元纤维缠结的标本相比(对照和Braak Ⅰ/Ⅱ期标本)，尸检后发现有新皮层神经元纤维缠结(Braak Ⅲ～Ⅳ期)的大脑标本中miR-153的水平明显降低。miR-153可影响APP和β淀粉样蛋白前体样蛋白(APLP)2的mRNA转录〔29〕。此外，在人额叶皮层，miR-153和APP在蛋白水平发生逆向共调控〔30〕。因此，miR-153可在转录后水平调控APP/APLP2的表达，但这种潜在的相互作用需要进一步的验证。

2.6miR-29miR-29家族可与BACE1 mRNA靶向结合，在散发AD患者中与BACE1的表达呈负相关。这种相关具有AD特异性，并在HEK293和SH-SY5Y细胞培养模型中得到验证。除了调节BACE1，在老年大脑中miR-29a/b升高，并可调控小胶质细胞活化〔31〕。miR-29簇已在散发性和家族性患者中确定序列，并且发现与AD密切相关的簇中存在变异〔32〕。然而，这一发现需要在大样本中进一步验证，并深入阐明这些变异的具体作用。

2.7miR-9miR-9是一种高度保守的大脑富集的miRNA，也是迄今为止AD中最常见的失调miRNA，miR-9可能存在上调或下调两种可能〔16〕。向体外原代培养神经元中添加Aβ可导致miR-9快速下降，表明miR-9下调可能与斑块形成相关〔33〕。miR-9的作用靶点包括神经原纤维缠结中的一种蛋白质神经丝重链(NFH)和去乙酰化酶SIRT1，SIRT1与tau蛋白相互作用，并增加过磷酸化tau蛋白的积累〔34〕。其他三个抑制SIRT1的miRNAs，即miR-181c，miR-34，和miR-132，在AD大脑显示一致的表达改变〔35〕。此外，miR-132有几个与AD发病机制直接相关的靶点，包括张力蛋白同源物(PTEN)，叉头蛋白O3A(FOXO)3A，和E1A结合蛋白P300，它们在神经细胞凋亡和乙酰胆碱酯酶(AChE)中都发挥重要作用。抑制AChE与胆碱能抗炎通路有关，是目前治疗AD的常规药物〔36〕。

2.8miR-34miR-34作为AD的另一个指标，他在体内有三种存在方式miR-34a，miR-34b。miR-34c，其中miR-34a，miR-34c被证实跟AD关系最密切。miR-34c在AD患者外周单核细胞和血浆中都有明显的升高，与同年龄的正常组对照。并指出miR-34c通过抑制参与细胞的存活和氧化防御途径的几个选定的基因的表达，如Bcl2，SIRT1等，实现神经细胞的凋亡进而导致AD的发生发展〔37〕。

3miRNA治疗AD的临床应用

目前已有多个miRNA治疗其他疾病的临床试验，如癌症和慢性丙型肝炎病毒感染〔38〕。并且预期在未来几年将有更多类似的临床试验及应用产生。miRNA的治疗应用主要通过两个策略：利用miRNA模拟物进行RNA干扰(RNAi)和通过miRNA拮抗剂抑制miRNA。已有大量的研究表明，应用RNAi技术靶向疾病相关基因，如BACE1和APP，在动物模型中表现出有益的作用〔39〕。但RNAi技术和传统的药物开发一样面临着同样的挑战，包括药代动力学、靶向特异性、疗效和毒性等〔37〕。而miRNA可以模仿自然发生的RNAi机制，因此可能毒性较低，并有证据表明治疗神经退行性疾病时，与其他的短发夹RNA(shRNA)相比，miRNA免疫激活明显降低。

miRNA作为治疗剂的一个优点是它可以影响多个靶基因和通路。然而，这也可能是不利的，因为这可能导致脱靶效应。每个miRNA可以靶向几百个mRNA,因此，了解miRNA与内源性RNA之间不期望的相互作用是显得十分重要。另外一个值得考虑的是，人工合成的miRNA可能抑制体内生物合成机制，从而削弱内源性miRNA的作用。因此，非经典合成途径的mirtron人工合成物有望成为未来miRNA治疗理想来源。

4结论

由于AD的发病机制涉及多条途径，目前临床上尚无根治AD的有效药物，只能对症治疗，无法缓解AD的病理进程。miRNA通过作用多个靶点和途径，显然将成为AD治疗的一个极具前景的有效策略。

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〔2015-01-22修回〕

(编辑李相军)

通讯作者：国海东(1981-)，男，博士，副研究员，硕士生导师，主要从事中医药防治心脑血管疾病研究。

基金项目：国家自然科学基金资助课题(81102670，31400838，81373754)

中图分类号〔〕R741.02〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6271-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.129