张武德　程卫东　鲍英存　赵　敏

(兰州大学第二医院中医科，甘肃　兰州　730030)



扶正抑瘤汤对肝癌Hu-7细胞诱导凋亡及自噬的作用

张武德程卫东1鲍英存赵敏

(兰州大学第二医院中医科，甘肃兰州730030)

摘要〔〕目的探讨扶正抑瘤汤对裸鼠移植瘤肝癌Hu-7细胞的诱导凋亡及自噬的调控作用。方法50只裸鼠分为五组，即模型组，扶正抑瘤汤高(按人小鼠等效剂量换算为0.3 g生药/25 g小鼠)、中(高剂量组稀释1倍)、低剂量组(中剂量组稀释1倍)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)组，每组10只，建立人肝癌细胞Hu-7移植瘤裸鼠模型，待肿瘤体积长到约100 mm3时开始用药，扶正抑瘤汤灌胃给药(1次/d)，5-Fu组(2次/d)和模型组采用腹腔注射(1次/d)，给药3 w，于停药第2天各组处死裸鼠，剥离肿瘤称重，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率；留取肿瘤组织，TUNEL染色检测扶正抑瘤汤对移植瘤细胞凋亡的作用；透射电镜(TEM)检测自噬体形成情况，Western印迹检测自噬相关蛋白(Beclin-1、Bnip3及LC3)表达变化。结果与模型组比较，5-Fu组与扶正抑瘤汤组均能诱导细胞凋亡，减缓瘤体生长速度，抑制肿瘤生长率以高剂量药物组效果最佳，与5-Fu组比较有统计学差异(P<0.05)。TUNEL染色发现，与模型组比较，扶正抑瘤汤组和5-Fu组染色后荧光显微镜下均可见着色凋亡细胞，且随着药物组浓度变化，呈剂量相关性，其中高剂量组诱导细胞凋亡作用最显著。电镜结果显示：扶正抑瘤汤高剂量组和5-Fu组均可见到大量自噬小体，自噬小体数量与药物浓度呈剂量相关性，其中高剂量组药物自噬小体数量较中、低剂量组多，模型组亦发现少量自噬小体；Western印迹检测结果显示：与模型组比较，扶正抑瘤汤各剂量组和5-Fu组均可使自噬相关蛋白Beclin-1、Bnip3及LC3表达上调，且与药物浓度有剂量相关性，其中高剂量药物组较中、小剂量组更优。结论扶正抑瘤汤对裸鼠肝癌转移瘤Hu-7具有抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并且可激活肝癌细胞Beclin-1、Bnip3及LC3蛋白的表达，从而诱导肿瘤细胞发生自噬，其中以高剂量组效果最佳。

关键词〔〕扶正抑瘤汤；肝癌；裸鼠；凋亡；自噬

1兰州大学中西医结合研究所

第一作者：张武德(1970-)，男，主任医师，博士，主要从事中西医结合研究。

中医认为，肿瘤为人体正虚邪客聚于体内所致。因此肿瘤在机体内的发生、发展及预后，与人体正气、邪气的强弱有关，因此，肿瘤的治疗与预后，取决于人体内部正邪双方斗争的结果。中药具有补充人体正气、提高机体免疫力的良好作用，同时还具有杀伤肿瘤细胞、阻滞细胞周期等抗肿瘤效应。扶正抑瘤汤由红芪、当归、莪术、墓头回四味药组成。当归、红芪为补气补血扶正的要药、也是甘肃地道药材，具有良好的补养人体正气，提高机体的免疫功能作用〔1,2〕。莪术、墓头回具有活血化瘀、清热解毒等祛邪作用，对肿瘤细胞的生存产生抑制作用〔3,4〕。本实验从诱导肿瘤发生凋亡和自噬两个方面探讨扶正抑瘤汤的抗肿瘤作用。

1材料与方法

1.1实验药物试验用药材均购于兰州市药材市场，经甘肃农业大学蔺海明教授鉴定。红芪、当归、莪术、墓头回按3∶1∶1∶3的比例组方，常规煎药，然后将药物浓缩至2 g生药/ml，4℃保存备用。注射用5-氟尿嘧啶(5-FU)，天津金耀氨基酸有限公司生产，15～25℃避光保存备用。

1.2试验动物与瘤株BALB/C-nu裸鼠50只，6～8周龄，体重18～22 g，SPF级，雌雄各半，在SPF级屏蔽系统辅以洁净层流柜环境中饲养。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格号：SKXK(甘)201106-0014。人肝癌细胞株Hu-7由兰州大学第二医院消化肿瘤研究所提供，由兰州大学第二医院中心实验室传代冻存。

1.3试剂TUNEL染色试剂盒(美国Sigma公司)；RPMI 1640培养基(恒星生物工程有限公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)；Triton-100宝信生物有限公司；抗体均购自Promag；BeyoECL Plus购自碧云天等。

1.4仪器CO2细胞培养箱(日本SANYO公司)；680型酶联仪(美国BIO-RAD公司)；XL型流式细胞仪(美国贝克曼COULTER公司)；JY92-2D超声波细胞破碎机(宁波新芝公司)，震动切片机Leika TV1000；荧光显微镜Olympus X51；彩色成像系统Olypus DP72；恒温箱：上海智诚 ZGP-A2050等。

1.5方法

1.5.1模型的分组及处理取对数生长期的Hu-7细胞，收集并调整细胞浓度至1×108个/ml，每只裸鼠以0.2 ml接种右腋下，所有动物接种在30 min内完成。待肿瘤体积约在100 mm3时，移植瘤模型建立完成。

1.5.2动物分组及给药根据模型小鼠性别分层，按肿瘤体积大小随机分为模型组，5-Fu组，扶正抑瘤汤高(3 g生药/25 g小鼠)、中(高剂量组稀释1倍)、低剂量组(中剂量组稀释1倍)，模型组每日腹腔注射0.9%生理盐水0.2 ml，5-Fu组每周腹腔注射两次5-Fu，剂量为17 mg·d-1·kg-1。每日固定时间治疗，连续21 d。

1.5.3药物对移植瘤的抗肝癌效应检测 试验期间动态观察肿瘤生长情况，每3天用游标卡尺测量肿瘤最大长径和短径，按公式计算每组动物的肿瘤体积。用药结束2 d后，处死小鼠，取瘤称重，计算每组的肿瘤生长抑制率。

1.5.4药物诱导移植瘤细胞凋亡的检测(TUNEL染色检测)移植瘤标本经甲醛溶液固定48 h，石蜡包埋，4 μm切片，TUNEL染色后显微镜下观察肿瘤组织凋亡情况。

1.5.5透射电镜观察瘤组织细胞的自噬小体将瘤组织剥离黄豆大小固定于3%的戊二醛，样品用1%锇酸固定，丙酮逐级脱水，Epon 812 包埋放置过夜，半薄切片光学定位，超薄(70 nm)切片，铀、铅染色，电镜下观察瘤组织细胞中的自噬小体。

1.5.6自噬相关蛋白的检测 将切取的各组新鲜瘤块组织充分研磨，过滤后提取肿瘤组织总蛋白，采用Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin-1、Bnip3及LC3的表达变化(结果用Image J软件分析)。

1.6统计学方法使用SPSS15.0统计软件行方差分析。

2结果

2.1各剂量组水煎液及5-Fu组对裸鼠移植瘤的抑制作用

2.1.1肿瘤生长曲线与对照组相比，药物组和5-Fu组均能抑制肿瘤的生长，且随药物浓度的升高呈剂量相关性，其中以高剂量组和5-Fu组效果最佳(P<0.05)。见图1。

2.1.2各组药物对移植瘤生长的抑制作用模型组裸鼠瘤体生长最快，5-Fu组和扶正抑瘤组均能抑制肿瘤的生长，高剂量组抑制肿瘤生长最显著，与5-Fu组比较有统计学差异(P<0.05)。见表1。

2.2TUNEL染色检测各剂量组及5-Fu组诱导裸鼠移植瘤细胞凋亡的作用各组均可见到凋亡后被染色的细胞，但其中对照组和扶正抑瘤汤低剂量组凋亡细胞最多，5-Fu组凋亡细胞最少，高剂量组次之。见图2。

图1　各组对裸鼠移植瘤生长的影响

组别平均瘤重(g)抑瘤率(%)模型组6.22505-Fu组3.151)49.391)扶正抑瘤高剂量组4.001)35.741)扶正抑瘤中剂量组4.851)22.081)扶正抑瘤低剂量组5.721)8.11)

与5-Fu组比较：1)P<0.05

图2　荧光显微镜下TUNEL染色后的各组瘤细胞(荧光显微镜下,×40)

2.3电镜观察自噬小体的形成扶正抑瘤各剂量组及对照组均可见双层膜包裹的自噬体，其中5-Fu组和扶正抑瘤高剂量组可见较多散在双层膜的自噬体，扶正抑瘤中、低剂量组中及对照组可见少量自噬体。见图3。

图3　电子显微镜下观察各组瘤细胞自噬小体(×40)

2.4Westen 印迹法检测自噬相关蛋白Beclin-1、Bnip3及LC3的表达变化5-Fu组和扶正抑瘤高剂量组能显著上调蛋白的表达水平(P<0.01)，扶正抑瘤中、低剂量组作用不明显。见图4，表2。

1.模型组；2:5-Fu组；3:扶正抑瘤汤高剂量组；4:扶正抑瘤汤中剂量组；5:扶正抑瘤汤低剂量组图4　Western印迹检测自噬相关蛋白表达

指标模型组5-Fu组扶正抑瘤高剂量组扶正抑瘤中剂量组扶正抑瘤低剂量组LC318231)221)2)182)162)Beclin-14281)241)2)151)2)52)Bnip313371)311)2)251)2)132)

与模型组比较：1)P<0.01；与5-Fu组比较：2)P<0.01

3讨论

肝癌是世界范围高发的恶性肿瘤，目前对肝癌的治疗仍没有较好的疗效，长期生存率仍然很低。因此，从中药入手寻找抗癌药物成为近年的研究热点。扶正抑瘤汤是赵建雄教授的临床经典方，临床及实验证明其具有明显的抗肿瘤功效〔5,6〕，但具体的作用机制不甚明了。本文以裸鼠肝癌移植瘤为研究对象，初步探讨了扶正抑瘤汤的抗肿瘤作用。

自噬被称为2型程序性死亡，是真核细胞内的一种溶酶体依赖性的高效亚细胞降解途径。研究证实，自噬广泛存在于真核细胞的病理和生理过程中，是一种高度保守的细胞行为，与细胞的生长、增殖，肿瘤的发生、发展过程有密切的联系。随着自噬的进一步研究，发现多种蛋白的表达与自噬有关，Beclin-1基因在大多人类乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中都有等位基因缺陷〔7〕，该种蛋白基因缺失与调节自噬和调节肿瘤发生的信号通路有着紧密的联系。人类与小鼠的体外研究已经证实自噬是抑制肿瘤发生的机制之一。研究发现Beclin-1杂合子缺失的小鼠发生自发性肝细胞癌的频率较高〔8〕，和正常肝脏细胞系相比，肝癌细胞中许多自噬基因(Atg5、Atg7 和Beclin-1)的表达和它们相关的自噬活性均减弱。试验证明，肝癌患者体内Beclin-1 mRNA和蛋白在肝癌细胞组织中的水平比邻近非肿瘤组织更低〔9〕。同时，侵袭性高的肝癌HCC细胞系和病情反复发作的HCC 组织比侵袭性弱的细胞系或组织自噬水平更低〔9〕。

Bnip3是Bcl-2家族中Bp-only亚家族的成员，在Bcl-2家族中。Bnip3属于促凋亡蛋白，主要通过促进线粒体通透性转运孔开放和线粒体的损伤来诱导凋亡。另外，Bnip3可通过与Bcl-2及Bcl-XL形成异构体，拮抗其抗凋亡作用〔10〕，也可增强Bax和Bak的促凋亡作用，并可诱导自体吞噬〔11〕。

自噬体膜标志性蛋白LC3是哺乳动物中酵母Atg8 基因的同源物，是细胞自噬膜的通用标记物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面。研究认为LC3是一种比较特异的自噬诊断相关指标。通过构建LC3与绿色荧光蛋白的融合蛋白，通过荧光显微镜科观察到LC3 在细胞中的具体定位。细胞中新合成的LC3经过加工，成为胞质可溶性LC3-Ⅰ，后者经泛素样加工修饰，与自噬泡膜表面的PE结合，称为LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ的含量在某种程度上反映了细胞的自噬活性。在营养丰富时LC3-Ⅱ的信号有时比LC3-Ⅰ更强；在免疫印迹实验中也更敏感〔12〕。

参考文献4

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〔2013-06-25修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者：程卫东(1963-)，男，教授，博士后，博士生导师，主要从事中西医结合研究。

基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金(lzujbky-2011-106)

中图分类号〔〕R735.7〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6036-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.014