一株鸡源新城疫病毒的分离鉴定

周灵1，李燕芳2，马夏利3

( 1.海盐县畜牧兽医局，浙江海盐314300; 2.海盐县畜牧兽医联站;3.海盐县武原镇畜牧兽医工作站)

摘要:从海盐县某鸡场发病鸡群采集的拭子样品中分离到1株病毒，血凝试验、血凝抑制试验结果表明，该病毒可与1%鸡血红细胞发生凝集，且这种凝集作用可被新城疫标准阳性血清所抑制。同时进行RTPCR检测，结果可扩增出目的条带，进而确定该毒株为鸡源新城疫病毒。根据OIE对新城疫病毒毒力的判定标准和方法对该病毒进行鸡胚平均致死时间( MDT)、1日龄易感雏鸡脑内接种致病指数( ICPI)和鸡胚半数致死量( ELD50)测定。结果表明，MDT =55.2 h，ICPI =1.76，ELD50=10－8.3/0.2 mL，最终判定该毒株为新城疫强毒株。

关键词:新城疫病毒;分离鉴定;毒力测定

中图分类号:S858.31文献标识码: A

收稿日期:2014-08-15

新城疫是由新城疫病毒( NDV)引起的一种急性、败血性传染病，对养鸡业危害极大。目前针对NDV的诊断技术，主要有临床诊断与实验室诊断。临床诊断依据出现典型的临床症状与病理变化作为判断标准，但有部分病毒性疾病与ND症状相似，所以要借助实验室才能进一步鉴定。实验室诊断包括采用鸡胚分离法、血凝和血凝抑制试验( HA和HI)、酶联免疫吸附试验( ELISA)等技术，同时可用核酸探针技术、RT-PCR、RNA指纹图谱法等分子生物学技术进行进一步鉴定。区别NDV毒力的方法很多，包括测定其生物学特性与根据其分子生物学特性建立的诊断方法等。

通过海盐地区鸡源新城疫病毒病的流行病学调查、进行病原学分子流行病学、快速检测诊断技术的研究，为有效防治鸡源新城疫病毒病提供了理论依据和技术支撑。

本研究以海盐地区病鸡组织中分离到的病毒为研究对象，进行了病毒分离鉴定，为后期疫苗研制和疫病防控提供了基础。

1　材料与方法

1.1试验材料鸡口腔拭子样品采自海盐县某鸡场发病鸡群，由海盐县畜牧兽医局实验室提供; 9～10日龄SPF鸡胚购自北京某实验动物技术有限公司。

主要试剂:宿主菌大肠杆菌( E.coli) DH5a由本室保存，质粒pMD18-T Vector、Trizol RNA提取试剂、各种限制性内切酶、ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker胶回收试剂盒、新城疫标准阳性血清、鸡禽流感H5、H7、H9，EDS-76标准阳性血清，1%鸡红细胞悬液(由本实验室配制)等。

1.2病毒分离将接种材料经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚5枚，0.1 mL/枚，37℃孵化，逐日观察。弃去24 h内死胚，每4 h照蛋一次，及时取出死亡鸡胚，置4℃保存，无菌收集24～96 h死胚尿囊液; 96 h活胚置4℃过夜后，无菌收集尿囊液。

用SPF鸡胚继续传代至第5代，收集尿囊液，－20℃保存备用。将病毒分离株命名为HY0920株。

1.3血凝试验( HA)根据OIE标准选取96孔血凝板进行血凝试验，每孔加入生理盐水25 μL。每排第1孔加入25 μL待检鸡胚尿囊液，充分混匀后，吸取25 μL加入第2孔，充分混匀后，吸取25 μL加入第3孔，依此稀释，至第11孔。

从第11孔吸取25 μL弃去，第12孔不加待检尿囊液作为阴性对照。每孔加入浓度为1%的鸡红细胞悬液25 μL，充分混匀。将充分混匀后的血凝板置于37℃温箱中，感作30 min，观察鉴定结果。

1.4血凝抑制试验( HI) 96孔血凝板，每孔加入生理盐水25 μL，分别于每排第1孔加入ND、EDS-76.AI( H5、H7、H9)标准阳性血清25 μL，充分混匀后，吸取25 μL加入第2孔，再充分混匀后吸取25 μL加入第3孔，依此稀释，至第11孔。

从第11孔吸取25 μL弃去，第12孔不加待检血清作为对照。每孔加入含4个血凝单位的病毒液25 μL( 2. 2. 1血凝试验中出现完全凝集的鸡胚尿囊液最大稀释度为1个血凝单位)。将其充分混匀后置于37℃温箱感作30 min后，再在每孔中加入浓度为1%的鸡红细胞悬液25 μL，充分混匀。将充分混匀的血凝板置于37℃温箱，感作30 min，观察结果。

1.5毒力测定

1.5.1鸡胚平均致死时间( MDT)测定将经过三次传代的鸡胚尿囊液用灭菌生理盐水进行1∶10稀释，每个稀释倍数分别接种5枚非免疫鸡胚，每胚接种尿囊液0.1 mL，37℃温箱孵育。弃去24 h内死亡鸡胚，每12 h照检一次，连续观察7 d，记录鸡胚死亡时间。

1.5.2易感雏鸡脑内接种致病指数( ICPI)测定将经过三次传代的鸡胚尿囊液用灭菌生理盐水1∶10稀释，脑内接种1日龄易感雏鸡，每羽接种尿囊液0.05 mL;另设对照组5羽，每羽脑内接种灭菌生理盐水0.05 mL;按分组进行严格隔离词养，观察8 d，每日进行记录打分;死亡计2分，发病计1分，正常计0分。OIE提供的毒力鉴定分型标准: ICPI值0.2～0.5为温和型，0.5～1.5为中等毒力型，1. 5～2.0为强毒力型。

1.5.3鸡胚半数致死量测定( ELD50)将经过三次传代的鸡胚尿囊液用灭菌生理盐水10倍递次稀释，分别接种于9日龄非免疫鸡胚尿囊腔，每胚接种0.2 mL，每8枚鸡胚为一个稀释组，接种后以石蜡封口，置于37℃温箱孵育;每天照蛋，弃去24 h内死亡鸡胚，24 h后死亡鸡胚置4℃冰箱保存;连续观察5 d，按照Reed-Muench方法计算ELD50。

2　结果与分析

2.1病毒分离培养与试验结果发现，鸡胚在接种尿囊液后32～72 h全部死亡。

检查胚体，出血严重，呈透明状，经第三次传代后死亡鸡胚时间基本稳定在42～60 h，死亡鸡胚尿囊液清亮，胚体出血，尤以头部最为严重。

2.2病毒鉴定

2.2.1血凝试验经三次传代的鸡胚尿囊液按照OIE标准进行血凝试验。结果发现鸡胚尿囊液可凝集浓度为1%的鸡胚红细胞，血凝价为29。

2.2.2血凝抑制试验经三次传代的鸡胚尿囊液按照OIE标准进行血凝抑制试验，结果发现采用新城疫标准阳性血清者可以抑制血凝作用，而采用EDS-76、AI( H5、H7、H9)标准阳性血清者则无抑制凝集作用。

2.3毒力测定

2.3.1鸡胚最小致死量平均死亡时间( MDT)测定

详见表1。

表1　HY0920分离株MDT测定结果

由表1可见，可致鸡胚全部死亡的最高稀释倍数为10－6，MDT =2* 48 +3* 60/5 =55.2 h。

2.3.2易感雏鸡脑内接种致病指数( ICPI)测定详见表2。

表2　HY0920分离株1日龄雏鸡脑内接种分离毒后发病、死亡情况

由表2可见，经过三次传代的鸡胚尿囊液对鸡胚有很强的致死作用，死亡率很高;对照组注射生理盐水全部正常存活。ICPI =141/80 =1.76。

2.3.3鸡胚半数致死量测定( ELD50)详见表3。

表3　HY0920分离株ELD50测定

由表3可见，测定的ELD50在8～9之间，按照Reed-Muench计算ELD50，ELD50=10－8.3/0.2 mL，即将病毒悬液作10－8.3稀释后，接种非免疫鸡胚，可使50%非免疫鸡胚死亡;每0.2 mL病毒含量为10－8.3ELD50。

3　小结与讨论

研究表明，本次海盐地区分离到的一株病毒( HY0920)为鸡源新城疫强毒株，血凝效价为29。MDT =55.2 h，ICPI =1.76，ELD50=10－8.3/0.2 mL。

目前区别NDV强弱毒的方法:一是根据NDV的生物学特性鉴定法评定，包括鸡胚平均死亡时间( MDT)测定，脑内接种致病指数( ICPI)测定，静脉接种致病指数( IVPI)测定等;二是依据NDV强弱毒株F基因的裂解位点差异而建立的各种RT-PCR鉴定法，按照OIE标准测定NDV毒力标准所得结果准确可靠，但工作费时、且有散毒危险。

随着分子生物学技术的快速发展，国内外学者对NDV各个基因序列的研究表明，NDV F蛋白氨基酸基序与毒力密切相关，强弱毒株在裂解位点的氨基酸序列有一定差异。本研究参照Genbank中的NDV强、弱毒株F基因序列及其F基因的保守序列，应用DNA Star软件Meg Align程序分析及在线软件Primer Explorer V3，根据强弱毒株的碱基差异与保守性设计了3套能区别NDV强弱毒株的LAMP引物，用以区分NDV强弱毒株。

农业部领导要求坚定不移地推动病死畜禽无害化处理机制建设

农业部新闻办公室消息:最近，农业部在浙江省嘉兴市召开病死畜禽无害化处理机制建设现场会议，总结病死猪无害化处理长效机制试点工作，分析当前形势，研究部署病死畜禽无害化处理机制建设有关工作。农业部领导强调，有效解决病死畜禽无害化处理问题刻不容缓。

各地要进一步总结推广试点工作经验和做法，加强病死畜禽无害化处理体系建设和监管工作，坚决杜绝随意抛弃、经营、屠宰加工病死畜禽等违法行为，确保病死畜禽基本实现无害化处理。

一是进一步完善试点工作，把试点区域建设成示范区域。

二是大力推广试点经验，全面推动病死畜禽无害化处理工作的顺利开展。

三是严格落实国办意见精神，确保各项政策落实到位。

四是因地制宜，合理规划建设无害化收集处理体系。

五是履职尽责，全面强化病死畜禽无害化处理监管。

春季是病死畜禽多发期，做好病死畜禽无害化处理工作尤为关键，各地要迅速部署，抓好落实，努力确保不发生乱抛病死畜禽危害环境和食品安全的现象。

专题论述