郑肖兰+贺春萍+高亚男+张广宁+习金根+郑金龙+梁艳琼+李锐+吴伟怀+易克贤

摘 要 根据形态及ITS序列对咖啡炭疽菌进行了鉴定，其次通过菌丝体生长速率法测定了咖啡炭疽病菌的生物学特性及其毒力。生物学特性测定结果表明：菌丝体生长最适合的温度为28～30℃，pH为7～8。赖氨酸和L-甘氨酸有利于菌丝体的生长，光照及碳源对菌落生长影响则不明显。室内毒力测定结果表明：97.5%腈菌唑对咖啡炭疽病菌的抑菌效果最好，其EC50为30.79 μg/mL；其次为95%粉锈宁，其EC50为216.30 μg/mL；接着为97.2%百菌清和98%抑霉唑，其EC50分别为305.61、360.77 μg/mL。

关键词 咖啡树 ；炭疽病菌 ；生物学特性 ；毒力测定

分类号 S435.712

Biological Characteristics and Toxicity Determination of the

Colletotrichum gloeosporioides penz from Coffee arabica Linn.

ZHENG Xiaolan1） HE Chunping1） GAO Yanan2） ZHANG Guangning2） XI Jingen1）

ZHENG Jinlong1） LIANG Yanqiong1） LI Rui1） WU Weihuai2） YI Kexian1）

（1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS， Haikou， Hainan 571101

2 College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228）

Abstract The Colletotrichum gloeosporioides penz from coffee was identified by conidium morphology and molecular biology. The biological characteristics and fungicides toxicity were tested by mycelium growth rate. The biological characteristic results showed that the optimal temperature for mycelium growth were between 28℃ and 30℃，the optimal pH values for mycelium growth was from pH7 to pH8，and the optimal nitrogen sources were lysine and leucine. In contrast， illumination and carbon source were insignificant for mycelium growth. The toxicity determination result showed that 97.5% myclobutanil was the greatest inhibited effect on mycelial growth， with the EC50 value of 30.79 μg/mL； following by 95% triadimefon with EC50 value 216.30 μg/mL. Then， 97.2% chlorothalonil and 98% enilconazole has better inhibition effect， the EC50 was 305.61 μg/mL and 360.77 μg/mL， respectively.

Keywords Coffee arabica Linn. ； Colletotrichum gloeosporioides ； biological characteristics ； toxicity determination

咖啡（Coffea arabica Linn.）是茜草科一种多年生常绿灌木或小乔木，全球种植面积近1 000万hm2，是一种主要饮料作物[1-2]。 在世界三大饮料作物（咖啡、 茶叶、 可可）中，咖啡的产量、产值及消费量均居首位。目前我国主要在云南省和海南省栽培种植[3]。随着近年咖啡种植面积的扩大，病虫害问题日益凸显。咖啡常见病害炭疽病有蔓延的趋势。该病曾在我国海南[4-5]、云南[6-7]等地相继发生。

目前，国外对咖啡炭疽菌研究较多的主要集中在咖啡浆果炭疽病，主要涉及病原学[8-9]、抗病育种[10-13]、寄主与病原互作[14-15]等。不过，此病目前在国内还未见有发生的报道。而在国内则主要针对C. gloeosporioides作了些相关研究，也即仅限于云南省咖啡炭疽病的症状识别[6]、海南省咖啡炭疽病的发病规律[4]和农药筛选[5]等方面研究。我国咖啡炭疽病病斑中心呈现灰白色，边缘呈黄色，至后期则完全变成灰色，并产生许多同心圆排列的黑色小点[16]。不过值得关注的是，在特定的条件下，如高温或高温多雨等条件下，炭疽菌可变得活跃，甚至可以导致坏死症状[4，17]。为此，本试验对采自海南咖啡胶孢炭疽病菌进行生物学特性及其毒力测定，以期为当地咖啡炭疽病的有效防控提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 咖啡炭疽病菌菌株

于海南省儋州市宝岛新村中国热带农业科学院品种资源研究所咖啡种植基地采集典型叶片病斑，带回实验室采用常规组织分离、及单孢纯化[18]，并经形态鉴定以及离体叶片回接验证，从而获得供试菌株Cf1。供试菌株现保存于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖（Potato Dextrose Agar， PDA）培养基（马铃薯200 g、葡萄糖16 g、琼脂粉 20 g、蒸馏水定容至1 000 mL）；Czapek's medium（硝酸钠2.00 g、磷酸二氢钾1.00 g、氯化钾0.50 g、七水硫酸镁0.50 g、硫酸铁0.01 g、蔗糖30.00 g、琼脂粉20.00 g、蒸馏水定容至1 000 mL），上述培养基均于121℃高压灭菌20 min后备用。

1.1.3 试剂

碳源（半乳糖、D-果糖、D-甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、α-乳糖）、氮源（赖氨酸、L-甘氨酸、乙酸铵、L-亮氨酸、硝酸钠、L-甲硫氨酸）均购自海南青峰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供试菌株菌丝体收集及基因组DNA的提取

利用马铃薯葡萄糖液体培养基对参试菌株进行摇菌，28℃，160 r/min 培养5 d后，对菌丝体进行收集。收集的菌丝体迅速于液氮中研磨，后进行基因组DNA提取。DNA提取采用真菌DNA提取试剂盒（E.Z.N.A Fungal DNA kit， Omega 公司，美国）提取，具体实验步骤参考其说明书进行。

1.2.2 rDNA-ITS区段PCR扩增

利用真菌rDNA-ITS通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，以及ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[19]，对病原菌基因组总DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增反应总体积为20 μL，其中10 μL的2×EcoTaq PCR SuperMix，上下游引物各0.5 μL（10.0 μmol/L），模板DNA 10～20 ng，最后ddH2O补充至20 μL。PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸5 min，15℃保存。取5 μL上述PCR扩增产物，于1%琼脂糖凝胶进行检测，最后在紫外灯下观察并照相。剩余PCR产物用于回收后连接克隆，抽取质粒后送往英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

1.2.3 病原菌的生物学特性研究

1.2.3.1 温度对菌丝体生长影响的测定

将咖啡炭疽病菌参试菌株置于PDA平板培养基中，28℃恒温扩大培养6 d后，在培养基同一半径周围用打孔器取直径为5 mm的菌丝块，接种于PDA平板中央，接种后分别在10、15、20、25、28、30与37℃下恒温培养。3次重复，6 d后利用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.3.2 光照对菌丝体生长影响的测定

以PDA为供试培养基，按1.3.1的方法接种后，分别在光暗交替（12 h光照，光照强度5 500 lx；12 h黑暗）、全黑暗和全光照3种光处理下28℃培养，设3次重复，6 d后利用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.3.3 pH值对菌丝体生长影响的测定

分别用0.1%盐酸及0.1%氢氧化钠将PDA培养基的pH分别调至3、4、5、6、7、8、9、10和11后，倒制平板、冷却后接种。28℃培养，6 d后利用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.3.4 碳、氮源对菌丝体生长影响的测定

以查氏（Czapek's medium）培养基为基础培养基，分别用相等质量分数的碳（半乳糖、D-果糖、D-甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、α-乳糖），以及氮（赖氨酸、L-甘氨酸、乙酸铵、L-亮氨酸、硝酸钠、L-甲硫氨酸）替换蔗糖和硝酸钠制备培养基。接种、培养温度及测量方法同步骤1.2.2.1。

1.2.3.5 杀菌剂对菌丝体生长影响的测定

通过预备试验，筛选出各药剂对病菌菌丝体生长具有一定抑制作用的浓度，作为各药剂的供试浓度。按照实验所需母液浓度，称取原药粉末于25 mL的容量瓶，加入溶剂 DMF 2.5 mL使原药完全溶解，摇匀后加入2滴TX-10稳定剂摇匀，再用无菌水定容至25 mL配制成供试药剂母液，用系列浓度梯度稀释法将母液制成系列浓度的含药培养基（表1）。以加入等体积无菌水的PDA平板为对照。培养基于超净台凝固后，用打孔器（Φ=0.5 cm）制取已培养6 d的咖啡炭疽病菌菌饼，接种于含药PDA平板中央，封口后于28 ℃恒温培养箱内培养。待对照菌丝体直径至少4 cm以上但不长满皿时，用十字交叉法测量供试病菌的菌落直径，计算生长抑制率，以及各药剂对咖啡炭疽菌的抑制中浓度EC50与相关系数r值。

1.2.4 数据统计

所有试验数据均采用SPSS 19.0统计软件进行统计，计算处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 病原菌鉴定结果

分离纯化获得的菌株经离体接种咖啡叶片，再分离获得的菌株镜检后，观察到相同形态特征的分生孢子（图1），并进一步采用ITS1/ITS4对其进行分子验证。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测获得一条大小为575 bp的扩增条带，与预期大小基本一致。其序列与GenBank中的序列经BLASTn比对、同源性分析揭示，与Colletotrichum gloeosporioides非常高的同源性，达99%以上。由此，根据形态特征并结合ITS分子序列特征，将供试菌株Cf1菌株鉴定为胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides Penz）。

2.2 不同温度对供试菌株菌丝体生长的影响

测定结果表明，供试菌株在15～30℃内菌丝体均能生长，其中在25～30℃下的菌丝体生长直径与其余温度差异到达极显著，菌落直径最大，由此表明，25～30℃为菌丝体最适合生长温度（表2）。

2.3 光照对供试菌株菌丝体生长的影响

在光暗交替（12 h光照12 h黑暗）、全黑暗和全光照等3种光照处理下，菌丝体生长差异并不显著，由此表明，光照对菌丝体生长影响并不明显（表3）。

2.4 不同pH对供试菌株菌丝体生长的影响

试验结果表明，供试菌株在不同pH培养基中生长存在差异，其中pH 7～8菌落直径最大，均达到50.0 mm，最适合其菌丝体生长；而pH 3～4和pH 11时，菌丝体菌落直径较小（表4）。

2.5 不同氮源对供试菌株菌丝体生长的影响

试验结果表明，供试菌株在不同氮源培养基上均能正常生长，菌丝体生长致密，菌落比无氮源对照茂盛。相比较而言，赖氨酸和L-甘氨酸中生长的菌落直径与其余氮源（乙酸铵、L-亮氨酸、硝酸钠、L-甲硫氨酸）差异极显著，由此表明，赖氨酸和L-甘氨酸更适合其菌丝体生长（表5）。

2.6 不同碳源对供试菌株菌丝体生长的影响

供试菌株在碳源为半乳糖以及D-果糖的培养基上长势与无碳对照差异不显著，而在其余5种碳源培养基上长势与无碳对照差异极显著，菌落直径均小于无碳对照。即供试碳源对其菌落生长无促进作用（表6）。

2.7 不同杀菌剂对供试菌株的毒力

不同杀菌剂对供试菌株毒力测定结果表明，5种供试药剂均有不同程度的抑制作用，其中97.5%腈菌唑的EC50值最小，为30.79 μg/mL；其次是95%粉锈宁、97.2%百菌清、98%抑霉唑，其EC50在216.30～360.77 μg/mL；然而，94%嘧菌酯的EC50为15 286.31 μg/mL，表明其对咖啡炭疽病菌几乎无效果（表7）。

3 讨论

炭疽病是咖啡的一种常见病害，几乎所有咖啡栽培的地区都有该病发生。目前已报道，至少3种炭疽菌能对咖啡致病。根据Hindorf[20-22]等调查咖啡炭疽菌群体后发现，与咖啡浆果炭疽病害相关的炭疽存在3个不同炭疽菌种，其一为由Colletotrichum coffeanum引起，在人工培养基Malt-Extract Agar上生长为黑色，第2种则由C. acutatum引起，离体条件下菌丝体为紫色；第3种为由C. gloeosporioides，该病除侵染叶片外，还可在成熟浆果上产生症状，即所谓的晚疫病[22]。

病原菌的生物学特性是监控病害发生的前提条件。本研究针对咖啡炭疽菌（C. gloeosporioides）的生物学特性及毒力等方面进行了研究。生物学特性研究结果表明：适合咖啡炭疽病菌菌落生长的温度范围为28～30℃，在25℃以下或30℃以上该菌菌落生长较慢。咖啡炭疽病菌对酸碱度的适应能力较强，在pH 3～11的范围内均能生长。在中性条件下菌落的长势最好，最适pH为7～8，在酸性和碱性条件下菌丝体长得都比较稀薄；在有无光照或连续光照的条件下均可正常生长；赖氨酸和L-甘氨酸更适合其菌丝生长，碳源对菌丝生长无促进作用。

杀菌剂敏感性试验表明，在5种供试杀菌剂中97.5%腈菌唑的EC50值最小，仅为30.79 μg/mL，其次为95%粉锈宁、97.2%百菌清、98%抑霉唑，其EC50在216.30～360.77 μg/mL；而94%嘧菌酯的EC50为15 286.31 μg/mL，其对咖啡炭疽病菌的抑制效果最差。已有研究结果表明，1∶3∶100波尔多液、800倍灭菌威、800倍甲基托布津对咖啡炭疽病的田间防效也很高[5]。因此，建议在病害发生期使用混剂或轮换使用以防止病害的扩展和蔓延，既可有效降低抗药性的产生，又可有效防控病害。

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