李静，龚成，曾锋( 麻城市人民医院，湖北麻城438300;湖北省中南医院)

单核细胞趋化蛋白-1对人卵巢癌CaOV3细胞黏附、侵袭能力的影响及其机制

李静1，龚成2，曾锋1
( 1麻城市人民医院，湖北麻城438300;2湖北省中南医院)

摘要:目的探讨单核细胞趋化蛋白-1( MCP-1)对人卵巢癌CaOV3细胞黏附、侵袭能力的影响及其机制。方法将对数生长期的人卵巢癌CaOV3细胞随机分为观察组和对照组，观察组经MCP-1( 20 μg/mL)预处理，对照组不予处理。两组行体外黏附试验，记录黏附Fibronectin、Collagen及Laminin蛋白的细胞数;行体内黏附试验，记录黏附的细胞球体数目、体积及部位;行细胞侵袭试验，记录穿膜细胞数。采用Western blotting法检测两组上皮-间质转化指标(上皮指标E-cadherin，间质指标Vimentin、N-cadherin)的表达。结果观察组黏附Fibronectin、Collagen 及Laminin蛋白的细胞数及穿膜细胞数均高于对照组，P均＜0.01。两组肿瘤细胞以细胞球体形式黏附在小鼠大网膜脂肪细胞部位，并且观察组黏附的细胞球体数目更多、球体更大。观察组E-cadherin低于对照组，Vimentin、N-cadherin均高于对照组，P均＜0.01。结论MCP-1可提高人卵巢癌CaOV3细胞的黏附、侵袭能力，可能与其促进上皮细胞间质转化有关。

关键词:卵巢癌;单核细胞趋化蛋白-1;黏附;侵袭;上皮细胞间质转化

卵巢癌不同于其他实体瘤，其侵袭转移方式主要局限在腹腔内部而很少发生血液转移［1～4］。腹腔黏附是腹腔播散的第一步，单个肿瘤细胞或肿瘤球体黏附在体腔器官的系膜细胞表面，进一步种植发生侵袭转移，从而形成转移灶［5］。单核细胞趋化蛋白-1( MCP-1)主要由单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等释放，对单核细胞具有趋化活性，并可以激活单核细胞和肿瘤相关巨噬细胞［6］。研究表明，卵巢癌患者癌组织及腹水中MCP-1水平升高，且MCP-1高表达的卵巢癌患者生存期低于低表达者［7～9］。目前，MCP-1表达升高是否与卵巢癌的腹腔播散有关尚不明确。2013年11月～2014年6月，我们观察了MCP-1对人卵巢癌CaOV3细胞侵袭、转移能力及上皮细胞间质化的影响，以期为了解卵巢癌腹腔播散机制并遏制其播散提供依据。

1　材料与方法

1.1材料人卵巢癌CaOV3细胞购自美国标准生物品收藏中心( ATCC)。BALB/c-nu小鼠6只，体质量16～20 g，购于北京华阜康公司。McCoy's 5A培养基及FBS购自美国Gibco公司，MCP-1蛋白及ELISA检测试剂盒均购于美国R＆D公司，E-cadher in、N-cadherin、Vimentine及GAPDH兔单抗均购自美国Epitomics公司，细胞染料PKH-67购于美国Sigma公司，Transwell小室购于美国Corning公司Matrigel购于美国BD公司，免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥公司。

1.2细胞培养及分组将CaOV3细胞置于含10% FBS的McCoy's 5A培养液(含青霉素100 U/mL及链霉素100 μg/mL)中，于37℃、5% CO2条件下传代培养。取对数生长期细胞随机分为观察组和对照组。

1.3 MCP-1对CaOV3细胞黏附能力影响的观察

1.3.1体外黏附试验观察组经MCP-1( 20 μg/mL)预处理12 h，对照组不予处理。将两组细胞按1×104/孔接种于备用的96孔板，每孔设6个复孔。包被Fibronectin 10 μg/mL、Collagen I 10 μg/mL、Laminin 5 μg/mL于4℃过夜，PBS洗净后，用1%牛血清白蛋白于37℃条件下封闭1 h。30 min后吸弃上清，PBS吹打掉未黏附细胞，100倍光镜下随机选取5个视野，计算黏附细胞数，取其平均值。

1.3.2体内黏附试验将CaOV3细胞用PKH-67染料染色，观察组经MCP-1( 20 μg/mL)预处理12 h，对照组不予处理。取1×106个细胞重悬在100 μL PBS中，分别注入小鼠(每组3只)腹腔。4 h后处死小鼠，洗净腹腔未黏附细胞。在荧光显微镜下观察两组胃大弯下部大网膜组织，于40倍光镜下随机选取3个视野，观察大网膜处黏附的肿瘤细胞球体数量和体积。

1.4 MCP-1对CaOV3细胞侵袭能力影响的观察两组行细胞侵袭试验。Transwell上室每孔加入50 μL的Matrigel( McCoy's 5A培养液按1∶5稀释)，37℃放置1 h。观察组经MCP-1( 20 μg/mL)预处理12 h，对照组不予处理。凝固后上室加入1×104的两组细胞(均经100 μL无血清培养基重悬)，下室加入600 μL含30% FBS的McCoy's 5A培养液，培养48 h。取出小室，用棉签拭去膜上层细胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，结晶紫染色10 min，PBS洗净后风干。高倍镜下选取5个不同视野，计算穿膜细胞数。

1.5 MCP-1对CaOV3细胞上皮-间质转化指标表达影响的观察采用Western blotting法。观察组经MCP-1( 20 μg/mL)预处理24 h，对照组不予处理。胰酶消化后，PBS洗涤。RiPA蛋白裂解液提取收集细胞蛋白，每孔50 μg上样量进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上，5% BSA封闭1 h，加入一抗( E-cadherin 1∶500，N-cadherin 1∶1 000，Vimentin 1∶1 000，GAPDH 1∶1 000)，4℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入HRP标记的二抗( 1∶3 000)，室温孵育1 h。TBST充分洗掉背景后，增强ECL底物曝光。以GAPDH为内参，采用Image J软件计算条带灰度值，蛋白相对表达量以目的蛋白和GAPDH的灰度比值表示。

1.6统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组细胞黏附、侵袭能力比较体外黏附试验结果显示，观察组与对照组黏附Fibtonectin蛋白的细胞数分别为( 424±25)、( 216±13)个，黏附Colla gen蛋白的细胞数分别为( 261±16)、( 126±9)个黏附Laminin蛋白的细胞数分别为( 326±35)、( 176 ±23)个;两组比较，P均＜0.01。体内黏附试验结果显示，肿瘤细胞以细胞球体形式黏附在小鼠大网膜脂肪细胞部位，观察组黏附的球体细胞数目为( 2.2±0.4)个，对照组为( 0.8±0.3)个，并且观察组黏附的球体更大。观察组穿膜细胞数为( 235± 12)个，对照组为( 126±8)个;两组比较，P＜0.01。

2.2两组上皮-间质转化指标表达比较见表1。

表1　两组上皮-间质转化指标表达比较(相对表达量，珔x±s)

3　讨论

卵巢癌病死率居妇科恶性肿瘤之首，确诊时绝大多数处于疾病中晚期。广泛的腹腔播散病灶和大量腹水是卵巢癌进展期的主要临床特征，以手术为主的综合治疗虽可延长患者的生存期，但绝大多数卵巢癌患者术后两年内会复发。卵巢癌细胞腹腔黏附是腹腔侵袭转移的第一步［11］，卵巢癌患者腹腔微环境中大量的免疫细胞包括巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、系膜细胞以及肿瘤细胞等相互作用，可能与促进肿瘤细胞抵抗失巢凋亡，并获得更强的恶性潜能有关［12］。因此，腹腔播散病灶可能是卵巢癌患者预后不良的主要原因。

上皮-间质转化过程指的是肿瘤细胞在疾病进展过程中失去上皮标志如E-cadherin，而获得N-cad herin、Vimentin等间质侵袭表型标志。卵巢癌细胞失去E-cadherin表达后，细胞之间连接减弱，侵袭细胞外基质能力增强，从而加速了卵巢癌的播散进程研究发现，卵巢癌患者癌细胞E-cadherin低表达是预后不良的标志［13］。因此，观察卵巢癌细胞上皮间质转化具有重要的意义。

研究发现，MCP-1可促进乳腺癌细胞的肺转移并可以促进头颈部肿瘤的进展［14，15］。我们在体内外分别进行了MCP-1对卵巢癌CaOV3细胞黏附能

力影响的观察。体外黏附试验结果表明，MCP-1预处理后，CaOV3细胞对细胞外基质Fibronectin、Collagen以及Laminin的黏附能力显著增加。体内黏附试验结果表明，MCP-1预处理后，小鼠大网膜处黏附的肿瘤细胞数量更多，球体更大。以上均表明，MCP-1可以促进肿瘤细胞获得更大的体内外黏附能力，从而加速腹腔播散过程。同时，MCP-1预处理卵巢癌CaOV3细胞的穿膜细胞数显著增多，间质指标Vimentin、N-cadherin均显著升高，上皮性指标E-cadherin则显著降低。这些结果表明卵巢癌微环境中的MCP-1能够提高肿瘤细胞的黏附、侵袭能力，并可能与其促进上皮细胞间质转化有关。但是关于MCP-1对卵巢癌细胞的调控机制仍需进一步探讨。

参考文献:

［1］Kenny HA，Chiang CY，White EA，et al.Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion ［J］.J Clin Invest，2014，124( 10) : 4614-4628.

［2］Latifi A，Luwor RB，Bilandzic M，et al.Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors［J］.PLoS One，2012，7( 10) : 46858.

［3］Pettee KM，Dvorak KM，Nestor-Kalinoski AL，et al.An mDia2/ROCK signaling axis regulates invasive egress from epithelial ovarian cancer spheroids［J］.PLoS One，2014，9( 2) : 90371.

［4］Kenny HA，Kaur S，Coussens LM，et al.The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin［J］.J Clin Invest，2008，118 ( 4) : 1367-1379.

［5］Vallen MJ，Schmidt S，Oosterhof A，et al.Primary ovarian carcinomas and abdominal metastasis contain 4，6-disulfated chondroitin sulfate rich regions，which provide adhesive properties to tumour cells［J］.PLoS One，2014，9( 11) : 111806.

［6］Ji WT，Chen HR，Lin CH，et al.Monocyte chemotactic protein 1 ( MCP-1) modulates pro-survival signaling to promote progression of head and neck squamous cell carcinoma［J］.PLoS One，2014 9( 2) : 88952.

［7］Ries CH，Cannarile MA，Hoves S，et al.Targeting tumor-associat ed macrophages with anti-CSF-1R antibody reveals a strategy fo cancer therapy［J］.Cancer Cell，2014，25( 6) : 846-859.

［8］Comito G，Giannoni E，Segura CP，et al.Cancer-associated fibro blasts and M2-polarized macrophages synergize during prostate car cinoma progression［J］.Oncogene，2014，33( 19) : 2423-2431.

［9］Su S，Liu Q，Chen J，et al.A positive feedback loop between mesenchymal-like cancer cells and macrophages is essential to breast cancer metastasis［J］.Cancer Cell，2014，25( 5) : 605-620.

［10］Gyorffy B，Lanczky A，Szallasi Z.Implementing an online tool fo genome-wide validation of survival-associated biomarkers in ovari an-cancer using microarray data from 1 287 patients［J］.Endoc Relat Cancer，2012，19( 2) : 197-208.

［11］Saika K，Sobue T.Cancer statistics in the world［J］.Gan To Ka gaku Ryoho，2013，40( 13) : 2475-2480.

［12］Carduner L，Leroy-Dudal J，Picot CR，et al.Ascites-induced shif along epithelial-mesenchymal spectrum in ovarian cancer cells: en hancement of their invasive behavior partly dependant on alphav in tegrins［J］.Clin Exp Metastasis，2014，31( 6) : 675-688.

［13］Strauss R，Li ZY，Liu Y，et al.Analysis of epithelial and mesen chymal markers in ovarian cancer reveals phenotypic heterogeneity and plasticity［J］.PLoS One，2011，6( 1) : e16186.

［14］Moisan F，Francisco EB，Brozovic A，et al.Enhancement of pacli taxel and carboplatin therapies by CCL2 blockade in ovarian canc ers［J］.Mol Oncol，2014，8( 7) : 1231-1239.

［15］Kristjansdottir B，Partheen K，Fung ET，et al.Early inflammatory response in epithelial ovarian tumor cyst fluids［J］.Cancer Med 2014，3( 5) : 1302-1312.

收稿日期:( 2014-11-10)

通信作者:曾锋，E-mail: 402892550@ qq.com

文章编号:1002-266X( 2015) 32-0025-03

文献标志码:A

中图分类号:R737.31

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.009