齐京鹏，史阿娉，丰帆，任贵，张洪伟( 西安医学院第一附属医院，西安70077;西电集团医院; 第四军医大学西京消化病医院)

胃动蛋白1在胃癌转移中的作用及其机制探讨

齐京鹏1，史阿娉2，丰帆3，任贵3，张洪伟3
( 1西安医学院第一附属医院，西安710077;2西电集团医院; 3第四军医大学西京消化病医院)

摘要:目的探讨胃动蛋白1( GKN1)在胃癌转移中的作用，及其是否与基质金属蛋白酶( MMP)家族及NF-κB信号通路有关。方法取对数生长期的人胃癌细胞MGC803、MKN-45和非肿瘤性上皮细胞HFE-145，采用实时荧光定量PCR法检测细胞GKN1 mRNA表达。将对数生长期的MKN-45细胞随机分为转染组、空载体组、对照组，转染组转染GKN1表达载体，空载体组转染空载体，对照组不予处理。采用MTT法检测各组转染后连续5 d的细胞增殖活性，细胞划痕试验检测划痕宽度，Western blotting法检测基质金属蛋白酶2( MMP-2)、MMP-9、NF-κB p65蛋白表达。结果人胃癌细胞MGC803、MKN-45中GKN1 mRNA相对表达量分别为0.172±0.024、0.231±0.031，非肿瘤性上皮细胞HFE-145中GKN1 mRNA相对表达量为1.024±0.264;两种人胃癌细胞GKN1 mRNA相对表达量均低于HFE-145细胞，P均＜0.05。培养第1、2天，转染组、空载体组、对照组细胞增殖活性比较，P均＞0.05;培养第3、4、5天，转染组增殖活性均低于空载体组、对照组，P均＜0.05。转染组划痕试验后48、72 h的划痕宽度均高于空载体组、对照组，P均＜0.05。转染组MMP-2、MMP-9、NF-κB p65蛋白相对表达量均低于空载体组、对照组，P均＜0.05。空载体组、对照组上述指标比较，P均＞0.05。结论GKN1在胃癌细胞中呈低表达，激活其表达可显著抑制肿瘤细胞转移，可能与其抑制MMP家族蛋白表达及NF-κB信号通路有关。

关键词:胃肿瘤;胃癌;胃动蛋白1;核因子-κB;基质金属蛋白酶

Role and mechanism of gastrokine 1 in gastric cancer metastasis

QI Jing-peng1，SHI A-ping，FENG Fan，REN Gui，ZHANG Hong-wei
( 1 The First Affiliated Hospital of Xi'an Medical College，Xi'an 710077，China)

Abstract:Objective To investigate the role of gastrokine 1 ( GKN1) in the metastasis of gastric cancer and to observe whether it is related with the matrix metalloproteinase ( MMP) family and NF-κB pathway.Methods Quantitative PCR was carried out to detect the GKN1 mRNA expression in the gastric cancer cell lines MGC803，MKN-45 and non-neoplastic epithelial cell line HFE-145 of the logarithmic phase.MKN-45 cells in the logarithmic phase were randomly divided into three groups: the transfection group ( group A)，non-load group ( group B) and the control group ( group C).Group A was transfected by GKN1 expression vector，group B was transfected by empty vector and the group C was not treated.MTT assay was used to detect the cell proliferation activities of the three groups for 5 days，cell scratch method was used to detect the scratch width，and Western blotting was employed to detect the protein expression of MMP-2，MMP-9 and NF-κB p65.Results The GKN1 mRNA relative expression levels of human gastric cancer cell lines MGC803 and MKN-45 were 0.172 ±0.024 and 0.231±0.031，and the GKN1 relative mRNA expression of the epithelial cells HFE-145 was 1.024± 0.264.The GKN1 mRNA expression of the two kinds of human gastric cancer cells was lower than that of HFE-145 cells ( all P＜0.05).No significant difference was found in the cell proliferation activity among the three groups of MKN-45 cells after being cultured for one or two days ( all P＞0.05).After being cultured for day 3，4 and 5，the cell proliferation activity of group A was lower than that of groups B and C ( all P＜0.05).The scratch width of group A after scratch test for 48

h and 72 h was higher than that of groups B and C ( all P＜0.05).The expression of MMP-2，MMP-9 and NF-κB p65 of group A was lower than that of groups B and C ( all P＜0.05)，and no significant difference was found between groups B and C ( all P＞0.05).Conclusions GKN1 in the gastric cancer cell lines shows lower expression and the activation of its expression can inhibit the metastasis of tumor cells，which may be related with its inhibition of MMP protein expression and NF-κB pathway.

Key words:stomach neoplasms; gastric carcinoma; gastrokine 1; nuclear factor-κb; matrix metalloproteinase

胃癌是一种消化道高发恶性肿瘤，具有高隐匿性及高转移性，多数患者发现时已经处于晚期进展阶段［1，2］。胃动蛋白1( GKN1)编码一种分子量为18 kD的胃窦黏膜蛋白，高表达于胃窦组织，在其他类型的胃肠黏膜组织中不表达［3］。GKN1可促进细胞分裂和增殖，具有促进胃黏膜损伤后愈合的作用。研究发现，GKN1可能具有胃癌特异性抑制基因的作用［4］; GKN1表达缺失时，胃黏膜上皮细胞不断增殖而不凋亡［5］。2014年1月～2015年3月，我们观察了GKN1在胃癌转移中的作用，并探讨其是否与细胞基质金属蛋白酶( MMP)家族蛋白表达及NF-κB信号通路有关。

1　材料与方法

1.1材料人胃癌细胞MGC803、MKN-45和非肿瘤性上皮细胞HFE-145，均由ATCC( American Type Culture Collection)提供。pcDNA3.1表达载体、脂质体2000均购于美国Invitrogen公司，遗传霉素G418购于日本Wako公司，逆转录试剂盒购于日本Takara公司。紫外分光光度仪购于美国NanoDrop公司，PRISM 7500荧光定量PCR仪购于美国ABI公司。

1.2 MGC803、MKN-45、HFE-145细胞培养及GKN1 mRNA检测将MGC803、MKN-45及HFE-145细胞在加入10%热灭活FBS的RPMI-1640培养基中进行传代培养，培养环境37℃、5% CO2。取对数生长期细胞，采用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度仪检测样本浓度和纯度。按照逆转录试剂盒说明书操作，逆转录生成cDNA，采用实时荧光定量PCR法检测细胞GKN1 mRNA相对表达量。引物序列: GKN1上游引物: 5'-CAAAGTCGATGACCTGAGCA-3'，下游引物: 5'-CTTGCCTCTTGCATCTCCTC-3';以GAPDH为内参，上游引物: 5'-AAATCAAGTGGGGCGATGCTG-3'，下游引物: 5'-GCAGAGATGATGACCCTTTTG-3'。循环体系25 μL: SYBR premix( 2×) 12.5 μL，目的基因上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件: 94℃预变性4 min、95℃变性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次; 72℃延伸1 min。采用琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，GKN1 mRNA相对表达量以2－ΔΔCt表示。

1.3细胞转染及相关指标观察

1.3.1细胞转染将对数生长期的MKN-45细胞随机分为转染组、空载体组、对照组。逆转录获取GKN1全长cDNA，将其克隆到pcDNA3.1表达载体通过脂质体2000转染至转染组;转染后细胞培养24 h，更换培养基，加入遗传霉素G418，调整G418在培养基中的终浓度为1 mg/mL;细胞在G418存在的情况下培养8周，采用Western blotting法筛选稳定转染并表达GKN1的MKN-45细胞。空载体组转染空载体;对照组不予处理，仅加入等量培养液。

1.3.2相关指标观察

1.3.2.1细胞增殖活性采用MTT法。取各组细胞培养24 h后，接种于96孔板，调整细胞数为2× 103个/孔，每孔设两个复孔。使用MTT试剂盒检测细胞增殖活性，每孔加入5 mg/mL MTT，培养4 h后弃上清。加入150 μL二甲基亚砜，摇床低速震荡10 min。采用酶标仪测定490 nm处各孔吸光度( OD值)，即细胞增殖活性，连续检测5 d。

1.3.2.2细胞迁移力采用细胞划痕试验。调整各组细胞密度为5×104/mL，接种至6孔板中，每孔设两个复孔。细胞完全贴壁后，用200 μL微量加样枪头在6孔板中划出一条穿过贴满孔底细胞的直线PBS洗去漂浮细胞，继续培养细胞。于划痕试验即刻及实验后24、48、72 h，采用倒置显微镜观察并记录从迁移起点至迁移最远点的细胞核间距，每个视野选择10个观测点。划痕宽度越大，表示细胞迁移力越低。

1.3.2.3 MMP-2、MMP-9、NF-κB p65蛋白表达采用Western blotting法。取各组细胞，PBS冲洗2次，胰蛋白酶消化后收集细胞至2.0 mL离心管中加入预冷的含蛋白酶抑制剂RIPA的细胞裂解液150 μL，涡旋震荡后离心，吸取上清，标准曲线法测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE浓缩胶及分离胶电泳，转印蛋白至PVDF膜; 5%脱脂奶粉封闭，一抗孵育，洗膜3次;二抗孵育，洗膜3次;化学发光显色定影。以GAPDH为内参，采用Fluorchem软件分析蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达量以目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值表示。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 MGC803、MKN-45及HFE-145细胞GKN1 mRNA相对表达量比较人胃癌细胞MGC803、MKN-45中GKN1 mRNA相对表达量分别为0.172 ±0.024、0.231±0.031，非肿瘤性上皮细胞HFE 145中GKN1 mRNA相对表达量为1.024±0.264;多组间比较，P＜0.05;两种人胃癌细胞GKN1 mR NA相对表达量均低于HFE-145细胞，P均＜0.05。

2.2各组细胞增殖活性比较培养第1、2天，各组细胞增殖活性比较，P均＞0.05。培养第3、4、5天转染组细胞增殖活性均低于空载体组和对照组，P均＜0.05。见表1。

表1　各组不同时点细胞增殖活性比较(珔x±s)

2.3各组划痕宽度比较各组不同时点划痕宽度比较，见表2。

表2　各组不同时点划痕宽度比较(珔x±s)

2.4各组MMP-2、MMP-9、NF-κB p65蛋白相对表达量比较转染组MMP-2、MMP-9、NF-κB p65蛋白相对表达量均低于空载体组、对照组，P均＜0.05;空载体组、对照组上述指标比较，P均＞0.05。见表3、图1。

表3　各组MMP-2、MMP-9、NF-κB p65蛋白表达比较(相对表达量，珔x±s)

图1　各组细胞MMP-2、MMP-9及NF-κB p65蛋白表达

3　讨论

流行病学调查结果显示，全球每年42%的胃癌新发患者来自中国，35%的胃癌死亡患者也来自中国。GKN属于胃肠道黏膜特异性表达蛋白，其家族包括3个成员，即GKN1、GKN2、GKN3，主要表达于胃组织细胞，少量表达于子宫、胎盘和十二指肠细胞。研究发现，GKN1在胃癌组织中的表达显著降低，具有胃癌特异性肿瘤抑制基因作用。本研究中人胃癌细胞MGC803、MKN-45中GKN1 mRNA相对表达量均明显低于非肿瘤性上皮细胞HFE-145，与胃癌组织中的研究结果相一致，进一步证实了GKN1的抑癌基因作用。

为明确GKN1对胃癌转移的作用及其机制，本研究构建了GKN1表达载体，并稳定转染至MKN-45细胞。结果显示，MKN-45细胞转染后的增殖活性迁移力显著下降。侵袭和转移是肿瘤重要的生物学特征，癌细胞转移的前提条件是对相邻胃黏膜细胞的细胞外基质和基底膜的破坏和降解，而MMP在这一过程中发挥重要作用［6］。MMP家族发挥降解细胞外基质和基底膜的作用，其中以MMP-2和MMP-9尤为显著［7，8］。多种肿瘤组织中可见MMP-2 和MMP-9的高表达［9，10］，有研究显示，胃癌组织中MMP-2的表达与胃癌浸润程度及远处转移密切相关［11，12］。本研究结果显示，随着GKN1表达上调胃癌细胞MMP-2和MMP-9表达均明显降低，说明抑制MMP家族蛋白表达是GKN1抑制肿瘤细胞转移的机制之一。大量研究显示，NF-κB可通过调控细胞凋亡而促进肿瘤的发生、发展［13］，其关键功能单位是p65亚基，多种肿瘤中可见NF-κB p65表达异常［14，15］。本研究发现，稳定转染GKN1表达载体的MKN-45细胞NF-κB p65蛋白表达水平显著降

低，提示GKN1的高表达会导致NF-κB p65的失活，继而引发细胞增殖活性和迁移力的下降。

综上所述，GKN1具有胃癌抑制基因作用，在胃癌细胞中表达降低;激活GKN1表达可显著抑制胃癌细胞的增殖活性和迁移力，其机制可能与抑制MMP家庭蛋白表达和NF-κB信号通路有关。GKN1可作为胃癌诊疗的潜在靶点，为胃癌的早期发现和治疗提供新的思路。

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收稿日期:( 2015-06-19)

通信作者简介:张洪伟( 1964-)，男，主任医师，主要从事消化道肿瘤的诊疗工作。E-mail: zhanghw@ fmmu.edu.cn

作者简介:第一齐京鹏( 1979-)，男，主治医师，主要从事胸腹部肿瘤的诊疗工作。E-mail: qijing396@ sina.com

基金项目:国家自然科学基金青年基金资助项目( 81301804)。

文章编号:1002-266X( 2015) 32-0001-04

文献标志码:A

中图分类号:R573.9

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.001