牛　利，韩德五，许瑞龄，周　鑫，屈重霄

(1. 山西医科大学病理生理学教研室，太原　030001；2.山西医科大学肝病研究所，太原　030001；

3.山西省人民医院病理科，太原　030012)

高糖高脂饮食诱导大鼠代谢综合征模型并发阿尔茨海默样变

牛利1,2，韩德五2，许瑞龄1,2，周鑫1,2，屈重霄3

(1. 山西医科大学病理生理学教研室，太原030001；2.山西医科大学肝病研究所，太原030001；

3.山西省人民医院病理科，太原030012)

【摘要】目的通过长期高糖高脂饮食导致动物出现代谢综合征合并阿尔茨海默(AD)样改变动物模型的研究。方法将48只SD大鼠随机分为2组，正常对照组(用普通饲料饲喂) 24只，高糖高脂组( 饲以高糖高脂饲料)24只，连续喂养12 个月。于实验第 6、9、12月末观察动物体重、肾周和附睾或子宫周围脂肪重量并计算Lee指数; 检测血液中代谢综合征相关生化指标的变化；Western blotting测定海马Tau蛋白含量及其磷酸化水平；ELISA法检测海马Aβ的含量；HE染色观察脑组织病理改变。结果与正常对照组相比，各阶段高糖高脂组大鼠体重、内脏脂肪重量明显增加; 血清中FPG、TG、LDL等明显升高，HDL显著下降；海马Aβ、P-tau较对照组明显升高，其差异有统计学意义;病理组织学显示模型组脑组织有明显的炎性浸润、小胶质细胞活化明显。结论高糖高脂饮食诱导大鼠代谢综合征动物模型可并发AD样变，可为老年痴呆动物模型的构建提供一个新的思路。

【关键词】阿尔茨海默病;代谢综合征;炎症;胰岛素抵抗;高糖高脂

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种中枢神经系统原发性退行性疾病，本病起病缓慢隐匿，病程呈进行性，病因迄今未明。AD患者最典型的临床表现是学习，记忆和认知功能的进行性减退，其海马组织中tau蛋白过度磷酸化和Aβ聚集形成SP，被认为是AD特征性病理改变[1]。AD 中，5%的病例为家族性AD(FAD)，95%的病例为散发性AD(SAD)[2]。SAD 是一种与年龄密切相关的疾病，是遗传与环境相互作用的结果，但其确切原因和发病机制目前尚不明确。对于AD的研究目前大多采用转基因动物，但其无法模拟人类缓慢发病的进程，因此有着的局一定的限性。

代谢综合征(MS)是以胰岛素抵抗为核心的各种代谢疾病的总称，是糖代谢异常、2型糖尿病、高血压、脂代谢紊乱、腹型肥胖，高胰岛素血症等多种代谢异常集簇发生在某一个体的异常病理生理现象。大量的研究表明，与代谢综合征相关的糖尿病、高血压、肥胖等往往是AD潜在的独立危险因素[3,4],故代谢紊乱可能是AD发病的始动因子[5]。本课题组采用高糖高脂膳食喂养大鼠一年，成功复制出肥胖、非酒精性脂肪性肝病、二型糖尿病、代谢性心肌病等代谢综合征相关疾病的动物模型[6]。本实验在此工作基础上，对高糖高脂诱导的代谢综合征大鼠模型的脑组织的相关指标进行测试和分析，力求寻找AD与代谢综合征的早期联系。

1材料和方法

1. 1实验动物

Sprague-Dawley 大鼠48只，雌雄各半，山西医科大学动物实验中心提供，生产许可证：SCXK(晋) 2009-0001，动物使用许可证：SYXK(晋)2009-0004。

1.2主要试剂和仪器

甘油三酯( triglyceride，TG) 试剂盒、低密度脂蛋白(LDL)试剂盒、高密度脂蛋白(HDL)试剂盒等购自中生北控公司；AβELISA试剂盒购自R&D；Tau、P-tau抗体购自Cell Signaling Technology；721 分光光度计购自上海第三分析仪器厂; SN-684 型放免 γ 计数器购自上海核所日环光电仪器有限公司。

1.3动物分组及模型的建立

48只大鼠适应性饲养 1 周后，随机分为 6 组: 6 月、9月、12月正常对照组，每组8只，以正常饮食喂养; 6月、9月、12月高糖高脂组，每组8只，采用高糖高脂膳食( 70% 正常饲料 + 20% 猪油 + 10% 蔗糖 +1% 胆 固 醇 + 0. 25% 胆 酸 ) 喂 养。正常组总热量13. 89 KJ / g，模型组总热量 68. 40 KJ / g。以上动物均于天黑前投食，自由饮水，每月末称体重1次。分别于实验第 6月末、9 月末、12月末取相应阶段的正常组及高糖高脂组大鼠，腹主动脉采血，3 500 r/min 离心备用; 断头处死，取脑组织一半于10% 中性甲醛固定液中固定，石蜡包埋切片。另一半冻存于-70℃冰箱待用。

1.4生化指标检测

严格按照试剂盒说明书进行。计算胰岛素抵抗指数( HOMA-IR) :HOMA-IR=( FPG×FINS) /22. 5。

1. 5病理学检查

10%中性甲醛溶液固定脑组织进行 HE 染色，光镜下观察脑组织病理学改变。

1. 6蛋白质印迹技术检测海马内Tau、P-tau蛋白的水平

取冻存的海马组织分别置于玻璃匀浆器内,加入蛋白裂解液在冰浴中反复研磨，裂解30 min, 于4℃离心机内12 000 r/min离心10 min,取上清液即为蛋白，取10 μL用Bradford法检测蛋白浓度,其余储存于-80℃备用，调整各上样量40 μLwell，用前加2×样本缓冲液并混匀,于100℃变性5 min, 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳, 4℃ PVDF转膜过夜，摇床上5%脱脂奶粉室温封闭2 h;分别与目的抗体4℃杂交过夜；PBST洗膜3次,每次10 min;杂交2抗(辣根酶标记的羊抗兔),室温摇床上孵育2 h；PBST洗膜3次,每次10 min; 加入发光液、曝光、显影，采用Quantity One (Bio-Rad Laboratories)对胶片进行灰度分析。

1.7统计学方法

2结果

2.1大鼠体重及内脏脂肪重量的变化

2.2代谢综合征相关指标的变化

模型组大鼠TG、LDL、FPG、HOMA-IR 等都明显升高(P<0.05)，HDL则明显降低。说明经过高糖高脂喂养后，动物出现了糖代谢异常，高甘油三酯血症，异常脂蛋白血症及胰岛素抵抗等一系列代谢综合症相关特征(表1)。

2.3 tau蛋白与Aβ的表达

图2 结果表明，模型组动物P-tau(s199)在6月就明显升高，9月达到最高值，且持续到12月仍较正常组明显升高；而P- tau(s396)在9月明显升高且达到最高值，一直持续到12月。模型组动物Aβ的表达在6,9,12月均明显高于正常组，其差异具有显著性。

2.4脑组织皮层病理学观察

图3(见文后彩插1)结果表明，正常组动物脑组织结构正常，模型组动物6月开始出现少量炎性细胞浸润，到12月时炎性细胞浸润最为严重。

3讨论

AD是一种中枢神经系统原发性退行性疾病，起病徐缓，病程呈进行性，病因迄今未明。由于人均寿命延长，老年人口迅速增长，AD患病人数必然相应增加，已成为许多国家的主要保健和社会问题之一。Yaffe等[7]对2 632名患者追踪调查结果表明，MS是认知功能下降的高危险因素。因此本实验在高糖高脂诱发代谢综合征模型基础上对动物脑组织进行了相关的研究，以求进一步发现AD与MS在早期的联系。我们的实验结果显示，模型组动物在出现代谢指标变化的同时会出现AD相关的特征性病理改变。且HE染色显示，模型组动物脑组织有大量炎性细胞的浸润，随着时间的推迟，炎性细胞浸润逐渐增多。目前认为，炎症是引起Aβ沉积的继发性反应，也是导致神经元退行性变的重要因素。外周炎症因子通过活化脑血管内皮细胞进入脑内，可引起中枢炎症反应，进而影响认知功能[8]，同时炎症因子激活脑内小胶质细胞，活化后的小胶质细胞又可分泌更多的炎症因子，从而形成恶性循环，使脑内炎症放大。McDonald等[9]研究表明 激活的小胶质细胞可产生大量的APP，成为更多 Aβ 的来源。Tamagno 等[10]的研究亦提示 Aβ 所致氧化应激生成的过氧化产物能够上调 β 分泌酶的表达，从而加快 APP 的异常剪切，产生更多的 Aβ。脑内炎症不仅促进脑内淀粉样蛋白 Aβ的聚集，还可使tau蛋白的过度磷酸化，从而促进AD发生。

注：NC:正常组动物；HSHF：高糖高脂组动物；VF: 内脏脂肪重量; BW: 体重。图1　体重、内脏脂肪、Lees指数的变化 Note.NC: Normal control group; HSHF: Model groups established by high-sugar high-fat diet. VF: Visceral fat weight; BW: Body weight.Fig.1　Changes of body weight, visceral fat, and Lee’s index in the rats.

甘油三酯(TGmmol/L)高密度脂蛋白(HDLmmol/L)低密度脂蛋白(LDLmmol/L)血糖(FPGmmol/L)胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)对照组(Control)0.080±0.0291.784±0.14120.622±0.1135.099±0.6291.685±0.1776月模型组(6M)0.556±0.151**0.501±0.112**2.878±0.337*11.709±0.471*3.604±0.202*9月模型组(9M)0.570±0.176**0.477±0.179**3.440±0.127**13.784±0.141**3.570±0.184**12月模型组(12M)0.562±0.143**0.434±0.125**3.447±0.099**14.657±0.171**3.390±0.227**

注：与对照组比较*P<0.05,**P<0.001。Note：compared with the control*P<0.05,**P<0.001.

注：N：正常组动物；6M：6月高糖高脂组；9M：9月高糖高脂组；12M：12月高糖高脂组；*P<0.05与正常组比较；# P<0.05与6月高糖高脂组比较。图2　脑组织Tau蛋白与Aβ含量Note: N: Control group; 6M: High-sugar high-fat diet for 6 months; 9M: High-sugar high-fat diet for 9 months; 12M: High-sugar high-fat diet for 12 months. *P<0.05, compared with the control group; # P<0.05, compared with the 6M group.Fig.2　Expressions of Tau proteins and Aβ in the brain tissue

中枢性胰岛素抵抗也是大家公认的SAD发病机制之一。胰岛素信号转导通路在中枢神经系统内广泛存在，其通路异常可影响脑内葡萄糖的代谢水平，而葡萄糖是脑内供应能量的主要物质。IR的产生不仅会影响脑组织的能量利用，同时也扰乱了大脑神经中枢信号的传递，因而导致患者认知功能障碍的发生。多项研究表明，胰岛素抵抗与认知功能下降或AD的危险性具有明显的相关性[11]。本实验通过长期高糖高脂饲养动物，出现了一系列代谢综合征相关疾病的动物模型，其基本特征除炎症外均存在胰岛素抵抗。外周炎症可参与并促进IR的发生，我们推测中枢的炎症同样也可促进中枢IR的发生;而且高糖高脂喂养大鼠模型在早期就已出现了肥胖[12]，导致体重和内脏脂肪含量明显增加，脂肪细胞发生分化异常，引起游离脂肪酸(FFA)水平增加并导致异位沉积。FFA增加与胰岛素抵抗的发生密切相关，可以影响胰岛素信号转导通路，抑制外周组织及中枢对葡萄糖的摄取，使葡萄糖氧化和非氧化利用发生障碍。因此，高脂饮食可通过影响胰岛素信号转导通路导致外周 IR，其胰岛素受体数目、PI-3K,PKB 及 GLUT4 水平在高脂饮食后均有所改变。脑内的IR 不会因高浓度的胰岛素水平，而下调其在细胞膜上的表达，但其与胰岛素的结合受饥饿、肥胖、老化和地塞米松治疗的影响。本实验后续结果显示，高糖高脂饮食同样可以通过影响胰岛素信号转导通路使中枢发生IR, PI-3K, PKB, 及GLUT3水平均会发生改变。

综上所述，动物在高糖高脂饮食喂养下，除可发生代谢综合症相关疾病，还可导致AD样改变，可作为研究早期老年痴呆较为贴合人类实际的动物模型。

参考文献：

[1]Rasgon N, Jarvik L. Insulin resistance, affective disorders, and Alzheimer’s disease: review and hypothesis [J]. J Gerontol A Biol Sci Med Sci, 2004, 59(2):178-83; discussion 84-92.

[2]李焱. 中枢胰岛素抵抗与阿尔茨海默病发病关系的认识 [J].诊断学理论与实践, 2009, 8(3): 248-251.

[3]Vanhanen, M, Koivisto, K, Moilanen, L, et al. Association of metabolic syndrome with Alzheimer disease: a population-based study [J]. Neurology, 2006, 67: 843-847.

[4]吴惠文, 韩德五, 许瑞龄, 等. 甘氨酸对高果糖饮食诱导的大鼠胰岛素抵抗认知功能损害的影响 [J]. Chin J Pathophysiol, 2012, 28(2): 302-307.

[5]Steen E, Terry BM, Rivera EJ, et al. Impaired insulin and insulin-like growth factor expression and signaling mechanisms in Alzheimer′s disease — is this type 3 diabetes？[J]. J Alzheimers Dis, 2005, 7: 63-80.

[6]周鑫, 韩德五, 李素红, 等. 高糖高脂致大鼠非酒精性脂肪肝合并高血糖动物模型的研究[J]. 中国比较医学杂志, 2011, 21(7) : 22-27.

[7]Yaffe K, Blackwell T, Kanaya AM, et al．Diabetes, impaired fasting glucose, and development of cognitive impairment in older women [J]. Neurology, 2004, 63(4): 658-663.

[8]Konsman JP, Parnet P, Dantzer R. Cytokine-induced sickness behaviour: mechanisms and implications [J]. Trends Neurosci. 2002, 25(3): 154-159.

[9]McDonald DR, Brunden KR, and Landreth GE. Amyloid fibrils activate tyrosine kinase-dependent signaling and superoxide production in microglia [J]. J Neurosci, 1997. 17: 2284-2294.

[10]Tamagno E, Parola M, Bardini P, et al. Beta-site APP cleaving enzyme up-regulation induced by 4-hydroxynonenal is mediated by stress-activated protein kinases pathways [J]. J Neurochem, 2005. 92(3): 628-636.

[11]石森. 2型糖尿病与阿尔茨海默病相关性探讨 [J].继续医学教育, 2012, 26(11): 36-39.

[12]周鑫, 韩德五, 许瑞龄, 等. 肠源性内毒素血症在代谢综合征相关疾病发生发展中的作用及其机制[J]. 中国病理生理杂志, 2012, 28(3): 492-498.

〔修回日期〕2015-06-17

研究报告

Alzheimer’s disease-like lesions may occur in and accompany the

high-sugar high-fat diet-induced rat models of metabolic syndrome

NIU Li1，2, HAN De-wu2, XU Rui-ling1,2, ZHOU Xin1，2, QU Chong-xiao3

(1. Department of Pathophysiology, 2. Institute of Liver Disease, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;

3. Department of Pathology, People’s Hospital of Shanxi Province, Taiyuan 030012

【Abstract】ObjectivesTo explore the relativity between Alzheimer’s disease (AD)-like lesions and metabolic syndrome models induced by high-sugar high-fat diet in rats. Methods Forty-eight Sprague Dawley rats were randomly divided into 2 groups．The control group (fed with normal diet, 12 rats) and high sugar and high fat group (fed with high-sucrose and high-fat diet, 12 rats) continuously for 12 months. At the end of 6, 9 and 12 months of the experiment, we observed the animal body weight and visceral fat weight. The blood lipid levels, blood glucose and MS-related biochemical parameters were determined. The brain tissues were examined by histopathology. The characteristic AD molecules hippocampus Aβ and Tau were detected using ELISA and Western blotting to confirm the presence of AD lesions in the brain. ResultsCompared with the normal control group, the body weight and visceral fat weight of the rats in the high-sugar high-fat groups were significantly increased; the levels of TG, FPG, LDL, HOMA-IR and hippocampus Aβ, phosphorylated Tau (p-Tau) were higher, but the level of HDL was decreased (P<0.05 for all)．The histopathological examination revealed inflammatory cell infiltration in the brain tissues. ConclusionsCharacteristic AD-like lesions may occur and accompany the rat models of metabolic syndrome, induced by high-sugar high-fat diet, and provide a new idea for the construction of Alzheimer’s disease animal models.

【Key words】Metabolic syndrome; Alzheimer’s disease, sporadic; Inflammation; Insulin resistance; High-sugar high-fat diet; Rats

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.006

【中图分类号】R-33

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856(2015) 08-0027-04

[通讯作者]韩德五(1934-)，男，教授，研究方向：肠源性内毒素血症与代谢综合征。Email: 535574141@qq.com。

[作者简介]牛利(1976-)，女，讲师，研究方向：代谢综合征与老年痴呆。E-mail: nltys2004@163.com。

[基金项目]国家自然科学青年基金(No. 81302220)；山西省自然科学青年基金(编号：2014021040-3)。