余增才，陈洁君，孙晶晶，郭秋平

(广州医药研究总院有限公司药物非临床评价研究中心，广州　510240)

Beagle犬血液标本在不同保存条件和保存时间对血液生化指标检测的影响

余增才，陈洁君，孙晶晶，郭秋平

(广州医药研究总院有限公司药物非临床评价研究中心，广州510240)

【摘要】目的探索Beagle犬分离后的血清在不同保存条件和保存时间对血液生化指标检测的影响，保证长期毒性试验中检测结果的可靠性。方法选取Beagle犬6只，雌雄各半，采集Beagle犬静脉血，制备血清后，分别在1 h内、冰箱(2～8)℃保存2、5、8、12 h、冰盒(2～10)℃中进行运输保存2、5、8 h、冰箱-20℃保存1、3、5 d对丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TCHO)、总胆红素(TBIL)肌酸激酶(CK)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、钙(CA)、乳酸脱氢酶(LDH)、 磷(P)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、钠(Na+)/钾(K+)/氯(Cl-)进行检测。结果(2～8)℃冰箱保存12 h内和(2～10)℃冰盒保存8 h内的血液生化值均无差异；与血清分离后1 h内结果比较， -20℃保存5 d的LDL-C差异有显著性(P<0.05)且变动百分率为39%， CK、LDH值有逐渐增大的趋势，但无统计学意义(P>0.05)，LDH的变动百分率达41%。结论根据Beagle犬血液标本在不同保存条件和保存时间对血液生化指标检测结果的影响的试验结果，在制备血清后，应该在1 h内进行检测，如未能在样本制备后1 h内检测，应将样本置于(2～8)℃环境并在12 h内进行检测，或置于约-20℃环境并在3 d内进行检测。要对血清标本进行运输的，应放置于冰盒(2～10℃)中，并在8 h内进行检测。

【关键词】犬，Beagle；保存条件；保存时间；血液生化指标

Beagle犬为新药安全性评价的常用动物，血液生化指标为长期毒性试验的常规检测指标[1,2]。血液生化指标检测是通过生物或化学方法检测血液中的各项指标的变化[3]，从而反映出受检者的健康情况，但不同的保存条件和保存时间的长短都会直接影响生化指标的检测结果，所以保证血液标本的保存质量具有十分重要的意义[4]。而制备分离后的待测血样如果不能及时进行生化测定，必然涉及到保存问题[5]，本实验通过采取不同保存条件和保存时间进行保存血标本，分别检测不同保存条件和保存时间后血标本的各项生化指标变化情况，为药物非临床评价中心实行多场所管理和外单位或异地送检血液生化学检查标本提供参考和数据支持。

1材料和方法[6,7]

1.1实验动物及饲养条件

1.1.1实验动物：6～10月龄普通级Beagle犬6只，(6～10)kg，雌雄各半。由广州医药工业研究院实验动物研究开发中心提供，动物生产许可证号：SCXK(粤)2008-0007。广东省实验动物质量监测合格证为：监证字2008A043号。以犬笼号及犬的耳号作双重编号，犬笼号进行插卡标识。

1.1.2饲养条件：动物由取得实验动物管理资格认可的人员饲养管理。动物饲养于普通级动物房犬观察室内，通风及光照良好，温度为(16～26)℃, 湿度为40%～70%。监测合格证号为监证字号：2008C075，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2008-0003。动物采用单笼饲养，饮水为经过滤装置后的自来水由动物自由摄取；饲料为定量喂食，成犬膨化颗粒饲养由广州医药工业研究院实验动物研究开发中心提供，营养和卫生符合GB14925-2001的要求。

1.2仪器设备

Sigma 3-18K冷冻台式离心机(德国Sigma公司)、7020全自动生化分析仪(日本日立公司)、K/Na/Cl﹣分析仪(美国Medica公司)。

1.3试剂

血液生化质控品与ALT、AST、ALP、TP、ALB、UREA、CREA、GLU、TCHO、TBIL、CK、GGT、CA、LDH、P、HDL-C、LDL-C、TG试剂盒由北京利德曼公司生产。K/Na/Cl﹣试剂包由美国Medica公司生产。

1.4方法

选取检疫合格的普通级Beagle犬6只，雌雄各半，采集Beagle犬静脉血，加盖于室温静置30 min～1 h,以2 000 r/min相对离心力20℃离心15 min，吸出血清在1 h内检测1次丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TCHO)、总胆红素(TBIL)肌酸激酶(CK)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、钙(CA)、乳酸脱氢酶(LDH)、 磷(P)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、钠(Na+)/钾(K+)/氯(Cl-)；然后将血清分装为3份，每份分装为每个检测时间1管：第1份放置在冰箱中(2～8)℃冷藏保存，在血清分离后2、5、8、12 h检测上述指标；第2份放置在冰盒(2～10)℃中保存并进运输过程，在血清分离后2、5、8 h检测上述指标；第3份放置在冰箱-20℃冷冻保存，第3份血清在冷冻后1、3、5 d检测上述指标。

表1　Bengle犬血清在2～8℃保存2、5、8、12 h与血清分离后1 h内结果比较

表2　Bengle犬血清在冰盒(2～10℃)中进行运输保存2、5、8h与血清分离后1h内结果比较

Tab.3Detection results of the serum samples of Beagle dogs preserved in refrigerator at -20℃ for

冰箱-20℃保存Preservationinrefrigeratorat-20℃指标Items1h内Withinanhour1d1day3d3days5d5daysALT(U/L)36.67±7.9936.50±7.7737.17±8.5937.83±7.49AST(U/L)28.33±5.4327.50±4.8527.67±4.2327.83±4.36ALP(U/L)88.00±18.1988.00±19.2284.00±17.2984.83±16.68TP(g/L)66.25±4.4467.13±5.1266.30±3.5567.40±4.68ALB(g/L)26.65±1.5826.98±1.3226.43±1.6926.43±1.79UREA(mol/L)6.30±0.586.31±0.646.31±0.606.43±0.60CREA(umol/L)79.43±6.3377.18±6.2178.77±4.1680.95±8.47GLU(mmol/L)5.56±0.235.52±0.195.47±0.235.40±0.31TCHO(mmol/L)4.18±0.504.71±1.034.15±0.494.24±0.48TBIL(μmol/L)1.08±0.400.98±0.420.97±0.481.03±0.45CK(U/L)128.67±31.33134.50±34.48132.50±33.97135.33±33.18GGT(U/L)3.17±1.473.33±1.033.67±1.033.33±0.82CA(mmol/L)2.75±0.092.75±0.112.75±0.122.76±0.10LDH(U/L)16.17±1.4717.67±2.8818.17±2.9323.00±7.35变动百分率为41%P(mmol/L)1.71±0.151.72±0.151.73±0.171.75±0.18HDL-C(mmol/L)4.34±0.564.38±0.534.27±0.503.77±0.48LDL-C(mmol/L)0.10±0.020.10±0.020.11±0.020.13±0.03*变动百分率为39%TG(mmol/L)0.48±0.090.49±0.090.50±0.100.52±0.09Na+(mmol/L)148.47±5.56148.10±5.21151.92±7.90148.85±5.59K+(mmol/L)4.50±0.154.51±0.124.58±0.204.47±0.18Cl-(mmol/L)116.82±2.35116.98±2.91120.98±5.28116.25±3.26

注：与1 h检测结果比较，*(P<0.05)，变动百分率计算公式：(d5- h1)/h1*100%

Note: Compared with 1 hour test results,*(P<0.05)，Percentage change formula: (d5- h1)/h1*100%

2结果

2.1Beagle犬血清在冰箱2～8℃保存2、5、8、12 h与血清分离后1 h内结果比较

结果见表1，差异均无显著性(P>0.05)。

2.2Beagle犬血清在冰盒(2～10℃)中进行运输保存2、5、8 h与血清分离后1 h内结果比较

结果见表2，差异均无显著性(P>0.05)。

2.3Beagle犬血清在冰箱-20℃保存1、3、5 d的结果与血清分离后1h内检测结果比较

除保存5 d的LDL-C差异有显著性(P<0.05)外，均差异无显著性(P>0.05)，CK、LDH值有增大的趋势，但无统计学意义；而LDH的变动百分率为41%，LDL-C的变动百分率为39%(表3)。

3讨论

Beagle犬为新药安全性评价的常用动物，血液生化指标为长期毒性试验的常规检测指标，在药物非临床研究工作中对血液生化指标的检测和分析至关重要，在评价药物对肝肾功能的影响时是通过各种生化实验方法监测与肝脏、肾脏功能代谢有关的各项指标，以反映肝肾的功能基本状况[8]。血液生化检测能为药物安全性评价实验和临床用药提供基础数据，所以在检测血液生化时，为了得到更加准确可靠的数据，应控制好样本的检测时间和样本保存条件。已有的文献报道[9]，Beagle犬血清在4℃存放24 h和48 h后的结果显示各项生化指标与放置前无明显差异，提示不经冻融，4℃保存相对较短时间(如48 h内)更能反映血液生化的“真值”。

本实验室通过Beagle犬血液标本在不同保存条件和保存时间对血液生化指标检测的比对实验，结果显示Beagle犬血清在冰箱2～8℃保存2、5、8、12 h与血清分离后1 h内结果比较，差异均无显著性(P>0.05)，与文献报道[9]的结果一致。

此外本实验还进行了Beagle犬血清在冰盒(2～10℃)中进行运输保存2、5、8h与血清分离后1h内结果比较，运输过程采用专用空调运输车，并用水银温度计记录冰盒内温度，结果差异均无显著性(P>0.05)，提示在冰盒(2～10℃)环境下进行运输8 h对血液生化检测结果无明显影响。

实验还进行了Beagle犬血清在冰箱-20℃保存1、3、5 d与血清分离后1h内结果比较，结果冰箱-20℃保存5d的LDL-C有显著性差异(P<0.05)，其他结果差异均无显著性(P>0.05)，CK、LDH值有增大的趋势，但无统计学意义；冰箱-20℃保存5 d的LDH与1h内的数据变动百分率达41%，可能是随着存放时间增长而出现数据波动大导致其标准差变大，而且LDL-C的变动百分率为39%，也出现较大的波动。所以，建议保存于-20℃环境的Beagle犬血清最好在3d内进行检测。

综上所述，根据Beagle犬血液标本在不同保存条件和保存时间对血液生化指标检测结果的影响的试验结果，在进行Beagle犬血样采集后，应及时制备、分离血清并在1 h内进行检测，如未能在样本制备后1 h内检测，应将样本置于(2～8)℃环境并在12 h内进行检测，或置于约-20℃环境并在3 d内进行检测。如要对血清标本进行运输，应放置于冰盒(2～10)℃中，并在8 h内进行检测。该试验研究旨在为药物非临床评价中心实行多场所管理[10]和外单位或异地送检血液标本时提供参考，保证检测结果的准确性。

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〔修回日期〕2015-07-02

研究报告

Influence of different preservation conditions and times on the

measurement of blood biochemical indicators in Beagle dogs

YU Zeng-cai, CHEN Jie-jun, SUN Jing-jing, GUO Qiu-ping

(Center for Drug Non-clinical Evaluation and Research，Guangzhou General Pharmaceutical

Research Institute Co., Ltd，Guangzhou 510240, China)

【Abstract】ObjectiveBeagle dogs are commonly used animal for drug safety evaluation. As the necessary parameters, blood biochemical indicators are detected in acute or chronic toxicity tests. This study aims at assessing the influence of different preservation conditions and different preservation time on blood biochemical indicators to ensure the reliability of test results of long-term toxicity assessment.MethodsSix Beagle dogs (3 males and 3 females) were used in this study. After collection and preparation of serum samples, biochemical indicators were detected after preservation in refrigerator at 2-8℃ for 1, 2, 5, 8, and 12 hours; after preservation in ice transportation boxes at 2-10℃ for 2, 5, and 8 hours; and after preservation in refrigerator at -20℃ for 1, 3, and 5 days. The biochemical indicators included alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (ALP), total protein (TP), albumin (propagated), urea, creatinine (CREA), glucose (GLU), total cholesterol (TCHO), total bilirubin (TBIL), creatine kinase (CK), gamma pancreatic acyl transferase (GGT), calcium (CA), lactate dehydrogenase (LDH), phosphorus (P), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), triglyceride (TG), sodium (Na+), potassium (K+) and chloride (Cl-). ResultsCompared with the results of samples preserved for 1 hour, the LDL-C result of that preserved in refrigerator at -20℃ for 5 days was significantly increased (P<0.05), and the coefficient of variation was 39%. The CK and LDH results of specimens preserved in refrigerator at -20℃ for 5 days was increased but not significantly (P>0.05), and the coefficient of variation of LDH was 41%. ConclusionsAccording to the test results of blood biochemical indicators in the Beagle dogs detected after different preservation conditions and different preservation time in this study, detection test should be done within 1 hour, if not, detection should be done within 12 hours for the samples preserved at 2～8℃, or within 3 days for the sample preserved at -20℃. For transportation of serum samples, the serum samples should be placed in the ice box at 2～10℃, and detection test should be done within 8 hours.

【Key words】Beagle dogs; Preservation conditions; Preservation time; Blood biochemical indicators

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.004

【中图分类号】R-33

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856(2015) 08-0018-05

[通讯作者]郭秋平(1978-)，女，高级工程师，博士，从事新药研发。13427595023@163.com。

[作者简介]余增才(1985-)，男，助理工程师，本科，从事临床医学检验。yzc6409634@163.com。

[基金项目]广州市科信局生物产业重大专项(编号：201300000052)；广州市海珠区科技计划项目(编号：2012-CG-01)。