健康妇女阴道乳杆菌的分离鉴定

武香玉，徐海燕，辛国芹，赵影，谷巍

(山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 271000)

摘要：目的以健康妇女阴道分泌物为分离源分离乳杆菌，寻求阴道优势乳杆菌，为治疗细菌性阴道疾病提供菌株基础。方法采用传统方法分离鉴定乳杆菌，筛选能产生过氧化氢的优势菌株，并用16SrRNA序列分析方法进行分子鉴定。并验证了其抑菌试验效果。结果从健康妇女阴道中分离到9种乳酸杆菌种属，主要有卷曲乳杆菌，格式乳杆菌，詹氏乳杆菌等，其他也有罗伊氏乳杆菌，约氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌。大多数乳杆菌都能产过氧化氢，且对病原微生物有一定的抑制作用。 结论卷曲乳杆菌，格式乳杆菌，詹氏乳杆菌等是妇女阴道内主要的乳杆菌种类，能产过氧化氢，并可以抑制病原菌生长。

关键词：阴道分泌物；乳酸杆菌；分离鉴定；过氧化氢

作者简介：武香玉，女，研究方向：微生物学，E-mail:wxy0601@163.com

中图分类号：R378.99+2文献标识码：A

Isolation and identification oflactobacillusfrom healthy women′s vaginas

WUXiang-yu,XUHai-yan,XINGuo-qin,ZHAOYing,GUWei

(ShandongBaolai-leelaiBioengineeringCo.,Ltd.,Taian271000,China)

Abstract：ObjectiveTo isolate lactobacillus from healthy female Vaginal Secretions,seek the advantage lactobacillus and provide a basis for treating bacterial strains vaginal disease.MethodsUsing traditional morphology analysis to identify lactobacillus.Screening for hydrogen peroxide-producing lactobacillus．Applying 16SrRNA sequence analysis molecular biology methods to identify it exactly.And had confirmed its bacteriostasis experiment effect.ResultsL.gasseri,L.crispatus,L.jensenii were the major species isolated from the healthy women,and the other types included L.johnsonii,L.acidophilus and L.fermentum.Most of these lactobacilli can produce hydrogen peroxide,and also had certain inhibitory action to the pathogenic microorganism.ConclusionL.crispatus,L.jensenii and L.gasseri were predominant species in the vagina of healthy Chinese women and can produce hydrogen peroxide.They had certain inhibitory action to the pathogenic microorganism.

Key words:Vaginal Secretions;Lactobacillus;Isolation and identification;Hydrogen peroxide

乳酸杆菌(Lactobacillusspp.)是妇女阴道微生态菌群的优势菌，对维持阴道微生态的平衡起重要作用。特别是能产生H2O2的乳杆菌，可以抑制其他细菌的生长，从而保护阴道健康。本研究通过采集健康育龄妇女阴道分泌物分离纯化乳杆菌，并对其进行鉴定，从而了解阴道中主要的乳杆菌种类，并分析其产过氧化氢的能力，为微生态方法治疗细菌性阴道疾病提供菌株和理论依据。

1材料与方法

1.1分离源阴道分泌物。

1.2培养基改良MRS培养基[1](菌株分离时培养基中添加1%的碳酸钙);H2O2鉴定MRS培养基[2]：MRS琼脂培养基中包含0.25 mg·mL-1的四甲基联苯胺、0.l mg·mL-1的辣根过氧化物酶。

2试验方法

2.1阴道分泌物的采集[3,4]泰安市88医院妇科体检处医生协助取样，用无菌棉拭子于阴道后1/3处一次性顺时针刮抹，须避免接触到外阴部和阴道口以防污染。取出后立即放至MRS液体培养基中，并编号记录。

2.2菌株的分离纯化及鉴定[5]将采样试管置于培养箱培养。取富集培养后的菌液依次稀释至10-2、10-3、10-4、10-5,各稀释度取0.1 mL涂平板(MRS+CaCO3)，2个重复，于37 ℃培养箱培养。挑取培养基上具有明显钙溶圈的菌落于斜面，革兰染色、镜检，直至确定为纯菌，将纯化后的乳杆菌菌株接种到MRS培养基培养后，置4 ℃冰箱中保存备用。

2.3产酸性能的测定[6]将分离的菌种按照2%接种量接种于改良的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养，测定发酵液的pH值。

2.4乳杆菌的初步鉴定凡是革兰染色阳性，H2O2酶试验阴性的菌株可初步确定为乳杆菌。

2.5乳杆菌属的鉴定[7]通过生长温度试验(15、45 ℃)、运动性试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验对疑似菌株进行属的鉴定。

2.6优势乳杆菌的筛选[8]应用H2O2鉴定MRS培养基筛选产H2O2的乳杆菌。接种后放置37 ℃厌氧菌培养箱中培养，后将长好的菌落暴露于空气中20 min，如果菌株能产H2O2，则这个菌的菌落会变蓝。

2.716SrRNA分子鉴定[9~11]PCR扩增引物： 1492r：5′-ggttaccttgttacgactt-3′，27f:5′-agagttgatcctggctcag-3′。

菌落PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，25个循环，72 ℃延伸10 min。

PCR产物经salt-free纯化后，PCR产物测序由博尚生物技术有限公司完成，要求双向测通。将拼接后的序列结果输入www.NCBI.nlm.nih.gov/blast，与GenBank数据库中的序列进行同源性比对。

2.8体外抑菌试验对能产过氧化氢的菌株测定了体外抑菌作用[12]。

3结果与分析

3.1乳杆菌的分离和纯化从采集的多份样品中共分离纯化出41株菌，并将其冻干保存。

3.2产酸性能的测定结果结果见表1。

表1　产酸性能的测定结果(测定20 h发酵液的pH值)

续表1：

菌种pH菌种pH菌种pHL-7-24.48大-5-33.72C2-6-104.39L-7-36.06大-7-73.91C2-6-13.98L-2-15.34大-7-43.76C2-6-114.33L-7-14.30大-1C2-5-44.27

由表1可见，所分菌株产酸性能尚可，部分菌株发酵液pH值低于4，大部分菌株pH值在4~5之间，5株菌的发酵液pH值高于5。

3.3乳杆菌属的鉴定所分41株菌均为革兰染色阳性，无芽孢，细长弯曲或球杆状、杆状，单个或成链。所有的菌均不运动，硝酸盐还原反应、H2O2酶试验阴性，不液化明胶，不产吲哚和H2S，在15 ℃培养条件下所有乳杆菌都不生长。

3.4产过氧化氢菌株的测定通过优势乳杆菌的筛选，其中菌落变为蓝色能产H2O2的菌株有FNE-3、FND-4、FND-1等21株菌。

图1　产H 2O 2菌落变为蓝色的菌

3.5分子鉴定结果结果见图2、表2。

图2　PCR电泳图

将所得到的序列输入www.NCBI.nlm.nih.gov/blast，与Genbank数据库的序列作比对，进行同源性分析，得到最相似的物种名，登录号及其相似率。根据BLAST比对的结果进行初步鉴定，然后筛选相关模式菌株的16S rRNA序列利用软件MEGA构建系统发育树，确定菌株的属种(见表2)。

3.6体外抑菌试验结果结果见表3。

由表3可见几乎所有的菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有抑制作用，对变形杆菌和沙门氏菌的抑制效果不如对金黄色葡萄球菌和大肠肝菌效果好。

表2　FNE-3等菌株鉴定结果

表3　FNE-3等菌株的抑菌效果

4结论与讨论

4.1从采集的多份样品中共分离纯化出41株菌并保存。

4.2对分离纯化的菌株进行产酸测定，属种鉴定及优势乳杆菌筛选试验，对其中性能较好的菌株16SrRNA分子鉴定，共鉴定了21株菌，主要有卷曲乳杆菌，格氏乳杆菌，詹氏乳杆菌，罗伊氏乳杆菌，约式乳杆菌，嗜酸乳杆菌等。并对其验证了抑菌效果，几乎所有的菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有抑制作用，对变形杆菌和沙门氏菌的抑制效果不如对金黄色葡萄球菌和大肠肝菌效果好。

4.3细菌性阴道疾病是妇科疾病的常见病，主要特征是阴道中的乳酸杆菌减少，致病菌数量增多，因而导致整个微生态的失衡，影响妇女的身心健康。常用的抗生素治疗容易破坏阴道菌群，导致病变反复发作和迁延不愈。而乳酸杆菌既可以抑制病原菌的生长，又对治疗阴道感染有显著的效果，调节阴道菌群平衡。因此我们从健康妇女阴道分泌物中分离乳酸杆菌，用以开发微生态活菌制剂，通过调节微生态平衡进行扶正治疗。

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