商宏恺 仝进毅

[摘要] 目的 通过观察羊胎盘糖皮质激素受体的变化，研究孕早期应用地塞米松对羊胎的影响。 方法 2005～2009年将108只羊随机分为对照组（生理盐水2 mL）和地塞米松组（地塞米松0.14 mg/kg肌注），应用免疫组化和western blot方法分析GR的表达。于孕50、100、125、140 d收集胎盘。 结果 在孕50 d和125 d的雌性羊胎，地塞米松增加了总GR蛋白表达量，但在孕125 d的雄性羊胎，地塞米松降低了总GR蛋白表达量。DEX没有改变GRα蛋白表达量。根据GRα的表达发现三种双核细胞亚型（++，+-，- -）。 结论 DEX对胎盘的作用是性别依赖的。DEX改变了胎盘对内源性糖皮质激素的反应。BNC的总体活力可能取决于三种亚型的分布比例。

[关键词] 地塞米松；胎盘；糖皮质激素受体；双核细胞；性别依赖

[中图分类号] R715.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）33-0028-04

对有早产迹象的孕妇应用合成糖皮质激素能显著降低新生儿死亡率和呼吸窘迫综合征发生的可能性[1，2]。在孕早期，糖皮质激素还可以应用于先天性肾上腺皮质增生症的治疗[3]。虽然现在已经有很多关于孕晚期应用糖皮质激素的研究，但仍缺乏关于孕早期应用糖皮质激素的治疗相关研究。双核细胞（BNC）是羊胎盘滋养细胞中具有分泌功能的细胞，能够分泌胎盘生乳素，从而对胎儿的生长发育起到重要作用[4]。糖皮质激素的作用需要通过糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）的介导[5]。GR有2个亚型，分别为GRα和GRβ。GRα是配体依赖性亚型，被认为是功能型受体，而GRβ为非配体依赖性，可能对GRα起到调节作用[6]。本研究观察羊孕早期应用地塞米松对GR的分布和GR蛋白表达量的影响。我们假设糖皮质激素的作用是性别特异性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

所有实验都经过伦理委员会的批准。在2005年1月～2009年12月期间怀有单胎的108只羊被分为对照组（n=59）和地塞米松组（DEX组，n=49）。对照组于孕50 d、100 d、125 d和140 d予2 mL的生理盐水，DEX组则予0.14 mg/kg 的地塞米松（H02AB02，Mayne Pharma，Australia）肌注，每12小时一次，共4次。此后取出羊胎盘，并放入液氮中速冻保存，或放入福尔马林溶液用于制作病理切片。

1.2 GRt、GRα和GRβ的定位

使用免疫组织化学染色GRt、GRα和GRβ。用兔抗人GRt抗体（MA1-510，Thermo Scientific，USA），浓度为1∶50或兔抗人GRα抗体（P-20：sc1002，Santa Cruz，USA），浓度为1∶100或兔抗人GRβ抗体（PA3-514，Thermo Scientific，USA），浓度为1∶100孵育24 h后，再用抗兔二抗（PK-4001 Vectastain ABC kit，Vector Laboratories，USA），浓度为1∶200孵育1 h。共设置3组阴性对照组：①仅使用一抗孵育；②仅使用二抗孵育；③仅用稀释液孵育。

1.3 GRt、GRα和GRβ的蛋白定量

取80 mg胎盘组织放入裂解液中，在冰上用电动匀浆器充分匀浆，12000×g，4℃低温离心15 min，收取蛋白。取80 μg蛋白加上5×上样缓冲液煮沸10 min。在6%SDS-Page凝胶上进行电泳后湿转至PVDF膜上，再用5%牛奶封闭1 h。将一抗稀释（GRt 1∶1000，GRα 1∶200，GRβ 1∶200）过夜孵化；PBS-T漂洗后按1∶1000比例稀释二抗，室温孵育1 h。应用ECL发光液（32209，Thermo Scientific，USA）显影后用凝胶成像仪成像。显影完毕后，彻底冲洗，按之前步骤孵育多克隆β-actin一抗（107K4800，Sigma，USA）抗体浓度1∶20000，二抗使用HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶20000，31458，Thermo Scientific，USA），再次显影、成像。使用Quantity One软件分析灰度比值，从而得出GRt、GRα和GRβ的蛋白相对表达量。将GRt的电泳条带切下后送专业公司进行蛋白结构分析。GRα和GRβ的蛋白特异性用公司配套的特异性阻断剂检验（GRα阻断剂：sc-1002 P，Thermo Scientific，USA；GRβ阻断剂：PEP-222，Thermo Scientific，USA）。

1.4 统计学分析

采用SPSS13.0统计学软件，正态分布变量以（x±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与之前研究结果相同，GRt和GRα分布于羊胎盘滋养细胞的细胞核与细胞质[7]。GR的分布不依赖于孕周、羊胎的性别以及是否给予地塞米松治疗。未发现有GRβ分布于羊胎盘中。此外，GRα的免疫组化染色发现了三种新的双核细胞亚型：两个细胞核均表达GRα（++），两个细胞核均不表达GRα（- -），一个细胞核表达GRα，另一个细胞核不表达GRα（+-）（封三图4A、4B）。

使用Western Blot测定GRt的蛋白，可在97-kDa处探测到单一的条带，将该条带取出后进行蛋白测序证实为GRt（Genbank：EU371026.1）。在对照组中，羊胎为雄性的胎盘GRt蛋白表达量在孕125 d为最高，然后开始持续降低（图1A）。而在羊胎为雌性的胎盘中GRt蛋白表达量在整个孕周无明显变化。在孕50 d和孕125 d且羊胎为雌性的胎盘中，DEX组GRt蛋白表达量明显高于对照组[孕50 d：（0.417±0.041） vs （0.887±0.235），P<0.05；孕125 d，（0.638±0.093） vs （1.070±0.152），P<0.05]。在孕125 d且羊胎为雄性的胎盘中，DEX组GRt蛋白表达量明显低于对照组[（0.671±0.130） vs （1.127±0.118），P<0.05]。

使用Western Blot测定GRα的蛋白，可在95-kDa处探测到单一的条带，该条带能够被GRα阻断剂所抑制。在对照组的孕140 d，GRα的蛋白表达量最低（图1B）。DEX没有改变GRα的蛋白表达量，与先前的研究类似，使用Western Blot测定GRβ的蛋白，可在97-kDa处探测到单一的条带，然而该条带并不能被GRβ阻断剂抑制。

3讨论

孕早期应用DEX能够对胎盘的发育和功能以及胎儿的生长产生一过性的影响，该影响因胎儿的性别而有所不同。在雌性胎儿的胎盘中，DEX能显著增加孕中期（孕50和125 d）GRt蛋白表达量，但在雄性胎儿的胎盘中，DEX能显著降低孕中期（孕125 d）GRt的表达量。GRα的蛋白表达量没有受到DEX治疗的影响。

糖皮质激素对GR的作用因不同的实验方案和不同的实验对象而有所不同[8-10]。在Hella S3系细胞中，给予DEX 24 h、48 h和2周后，均能显著降低GR的mRNA表达量，而当清除DEX后，这种效果就不复存在[11]。若给予长达2年的慢性DEX刺激，GR的mRNA和蛋白表达量均无明显变化[11]，提示治疗时间的长短对于GR有不同的作用。在羊胎盘上的研究表明，将地塞米松直接注入到胎儿体内，会增高GRα的蛋白表达量，但却不会改变GRt蛋白表达量[12]。此外，在人胎盘中，产前应用倍他米松没有改变GRt和GRα的表达[13]。

在本研究中，按照孕周和胎儿性别分组，我们成功地检测了各小组的GRt和GRα蛋白表达。在雌性胎儿的胎盘中，GRt蛋白量在整个孕周都无明显变化，但在雄性胎儿的胎盘中，GRt蛋白表达在孕125 d最高，此后显著下降。所有羊胎盘中，GRα蛋白表达量在孕140 d是最低的，其原因可能是接近分娩时的内源性皮质激素高峰对胎盘功能的抑制有关。在雌性胎儿中，早期应用DEX显著增加了孕中期（孕50 d和孕125 d）GRt蛋白表达量，但在雄性胎儿中，DEX显著降低孕中期（孕125 d）GRt蛋白表达量。这可能提示雌性胎儿更倾向于保持GC的敏感性，或许是为了保持生殖能力和种族延续，而雄性胎儿在遇到升高的GC时，选择降低GC的敏感性。在既往的动物和人体研究中均曾发现这种性别依赖性改变，如早期给予DEX治疗，会导致雌性胎儿的顶臀长和体重暂时的下降，增加胎盘中的细胞凋亡[14，15]；Saif等[16]发现在糖皮质激素调节路径中，存在性别差异，同时脐血的糖皮质激素水平也有性别差异，提示雄性可能容易对糖皮质激素产生抵抗，而雌性则对糖皮质激素更敏感。

采用Gupta等[12]研究中所用的GRβ抗体，我们没能检测到胎盘中GRβ的表达，与Root等[17]的结果相同。在我们的研究中，97-kDa处的条带显示非常弱，并且不能被GRβ阻断剂所抑制，因而我们认为在羊胎盘中，GRβ的表达量可能非常低，或者先前文章中提到的GRβ条带其实是非特异性的。在最近的一项研究中，Saif等[16]在人胎盘中发现了12个GR亚型，这些亚型分布因不同的细胞、不同胎儿性别而有所不同，其中一些亚型不在每个人中都有分布。因此，我们的研究结果可能提示其他GR亚型也在羊胎盘中存在，这也能解释为什么GRt蛋白发生了变化而GRα蛋白量却未受到影响。

既往研究表明BNC的分布会影响OPL等蛋白的表达[18]。我们的研究根据是否表达GRα，可将BNC分为三种新的亚型。然而这三种亚型有什么不同的功能，目前还知之甚少。至今为止，人们普遍认为BNC可能是来自于一个单核细胞的特殊分裂形式（仅细胞核分裂而细胞质不分裂）[19，20]。但最近有研究报道，在人脑中BNC的形成来自于两个单核细胞相互融合[21]。因此这三种不同形式的BNC可能代表了一个BNC的不同发育阶段。我们假设（++）是一种“功能型”或“成熟的”BNC，（- -）是“无功能型”或是“未成熟型”BNC，而（+-）则是“中间型”BNC。而BNC的总体活性可能取决于这三种细胞的分布比例。

综上所述，发现三种不同BNC亚型，三种亚型的分配比例可能决定了BNC的整体活性。我们的研究揭示了内源性GC和（或）外源性GC能通过GR对胎儿和胎盘发育造成影响。通过观察糖皮质激素的治疗对胎盘细胞功能的影响，我们的研究还为人们对胎盘应对外界变化中所处的角色研究提供了新的认识。

[参考文献]

[1] Roberts D，Dalziel S. Antenatal corticosteroids for accelerating fetal lung maturation for women at risk of preterm birth[J]. The Cochrane Database of Systematic Reviews，2006， 3：CD004454.

[2] Liggins GC，Howie RN. A controlled trial of antepartum glucocorticoid treatment for prevention of the respiratory distress syndrome in premature infants[J]. Pediatrics，1972， 50（4）：515-525.

[3] Forest MG. Recent advances in the diagnosis and management of congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency[J]. Hum Reprod Update，2004，10（6）：469-485.

[4] Braun T，Meng W，Shang H，et al. Early dexamethasone treatment induces placental apoptosis in sheep[J]. Reproductive sciences，2015，22（1）：47-59.

[5] Nakagawa H，Groothuis DR，Owens ES，et al. Dexamethasone effects on vascular volume and tissue hematocrit in experimental RG-2 gliomas and adjacent brain[J]. Journal of Neuro-oncology，1988，6（2）：157-168.

[6] Funder JW.Mineralocorticoids，glucocorticoids，receptors and response elements[J]. Science，1993，259（5098）：1132-1133.

[7] Braun T，Li S，Moss TJ，et al. Maternal betamethasone administration reduces binucleate cell number and placental lactogen in sheep[J]. The Journal of endocrinology，2007， 194（2）：337-347.

[8] Lacroix A，Bonnard GD，Lippman ME. Modulation of glucocorticoid receptors by mitogenic stimuli，glucocorticoids and retinoids in normal human cultured T cells[J]. J Steroid Biochem，1984，21（1）：73-80.

[9] Cidlowski JA，Cidlowski NB. Regulation of glucocorticoid receptors by glucocorticoids in cultured Hela S3 cells[J].Endocrinology，1981，109（6）：1975-1982.

[10] Svec F，Rudis M. Glucocorticoids regulate the glucocorticoid receptor in the AtT-20 cel[J]. The Journal of biological chemistry，1981，256（12）：5984-5987.

[11] Silva CM，Powell-Oliver FE，Jewell CM，et al. Regulation of the human glucocorticoid receptor by long-term and chronic treatment with glucocorticoid[J]. Steroids，1994， 59（7）：436-442.

[12] Gupta S GS，Lye SJ，Gibb W，et al. Effect of labor on glucocorticoid receptor （GRTotal，GRα，and GRβ）proteins in ovine intrauterine tissues[J]. Journal of the Society for Gynecologic Investigation ，2003，10（3）：136-144.

[13] Johnstone JF，Bocking AD，Unlugedik E，et al. The effects of chorioamnionitis and betamethasone on 11beta hydroxysteroid dehydrogenase types 1 and 2 and the glucocorticoid receptor in preterm human placenta[J]. Journal of the Society for Gynecologic Investigation，2005，12（4）：238-245.

[14] Braun T，Li S，Sloboda DM，et al. Effects of maternal dexamethasone treatment in early pregnancy on pituitary-adrenal axis in fetal sheep[J]. Endocrinology，2009，150（12）：5466-5477.

[15] Li S，Sloboda DM，Moss TJ，et al. Effects of glucocorticoid treatment given in early or late gestation on growth and development in sheep[J]. Journal of developmental origins of health and disease，2013，4（2）：146-156.

[16] Saif Z，Hodyl NA，Hobbs E，et al. The human placenta expresses multiple glucocorticoid receptor isoforms that are altered by fetal sex，growth restriction and maternal asthma[J]. Placenta，2014，35（4）：260-268.

[17] Root B，Abrassart J，Myers DA，et al. Expression and distribution of glucocorticoid receptors in the ovine fetal adrenal cortex：effect of long-term hypoxia[J]. Reproductive sciences，2008，15（5）：517-528.

[18] Wooding FBP，Morgan G，Monaghan S，et al. Functional specialization in the ruminant placenta： Evidence for two populations of fetal binucleate cells of different selective synthetic capacity[J]. Placenta，1996，17（1）：75-86.

[19] Sibley CP，Birdsey TJ，Brownbill P，et al. Mechanisms of maternofetal exchange across the human placenta[J]. Biochemical Society transactions，1998，26（2）：86-91.

[20] Snoeck J. The physiology of the human placenta[J]. Triangulo，1962，（5）：180-190.

[21] Kemp K，Gray E，Wilkins A，et al. Purkinje cell fusion and binucleate heterokaryon formation in multiple sclerosis cerebellum[J]. Brain：A Journal of Neurology，2012， 135（10）：2962-2972.

（收稿日期：2015-10-09）