针药结合疗法对帕金森病模型小鼠纹状体区多巴胺D1、D2受体活性的影响

陈洁1，姜超2，陆征宇1，张琦君1

摘要：目的探讨针药结合疗法对帕金森病(PD)模型小鼠纹状体区多巴胺D1、D2受体活性的影响。方法将C57B L/6雄性小鼠随机分为正常组、模型组、针刺组、中药组、西药组及针药结合治疗组，每组再随机分为7天组(n=7)和14天组(n=7)，应用腹腔内注射(MPTP)的方法制备PD模型小鼠。针刺组针刺百会、运动前区(双侧)、哑门；西药治疗组灌胃美多巴；中药组灌胃中药PD方；针药结合组针刺和中药同时施行，方法同中药组和针刺组。用免疫组化法观察治疗后PD模型小鼠脑内纹状体区多巴胺(DA)D1、D2受体活性的影响。结果针药结合组、西药治疗组小鼠脑内纹状体区DA的D1、D2受体活性与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。西药治疗PD模型小鼠，其模型小鼠纹状体区D1、D2受体活性改善最佳，最接近正常组D1、D2受体活性指标。针药结合治疗改善PD模型小鼠纹状体区D1、D2受体活性优于单纯中药治疗及针刺治疗。结论西药美多巴治疗PD，改善该病多巴胺D1、D2受体活性且具有明显优势，针药结合对PD的治疗优于传统单纯中药治疗及针刺治疗。

关键词：帕金森病；针药结合疗法；免疫组化；多巴胺；小鼠

中图分类号：R742R285

收稿日期：(2014-10-05)

Effects of Acupuncture Combined with Herbar Medichines on Striatal Dopamine D1 and D2 Receptor Activity in Mice with Parkinson’s Disease

Chen Jie，Jiang Chao，Lu Zhengyu，Zhang Qijun

Yueyang Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200433，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture combined with herbal medicine on striatal neurotransmitters dopamine (DA) of D1 and D2 receptor activity in mouse with Parkinson's disease(PD).MethodsTwenty-eight adult male C57B L/6J mice were randomly divided into normal control group，PD model group，acupuncture group，herbal medicine group，western drug group，and acupuncture and herb combination group.Each group was divided into 2 subgroups，the 7-day and 14-day(n=7).The PD models were established with intraperitoneal injections of MPTP in C57/BL mice.The mice in acupuncture group were applied to Baihui，section of premotor area(both sides)，Yamen The mice in western drug group were treated with madopa.The mice in herbal medicine group were treated with PD prescription.The mice in acupuncture and herb combination group were treat with both acupuncture and herbal medicine.The effect of striatal neurotransmitters DA of D1 and D2 receptor activity were measured by immunohistochemical method after treatment.ResultsThere were significant differences on striatal neurotransmitters DA of D1 and D2 receptor activity among the acupuncture combined with herbal medicine group，the western drug group and the normal control group(P<0.01).The striatal neurotransmitters DA of D1 and D2 receptor activity demonstrated a significant improvement in western drug group comparing to other groups.The striatal neurotransmitters DA of D1 and D2 receptor activity demonstrated a significant improvement in the acupuncture combined with herbal medicine group，which comparing to the acupuncture group and the herbal medicine group. ConciusionMadopa can effectively improve the striatal neurotransmitters DA of D1 and D2 receptor activity.The acupuncture and herb combination group was more significant than the acupuncture group and the herbal medicine group in improvement of the striatal neurotransmitters DA of D1 and D2 receptor activity.

Key words：Parkinson’s disease；acupuncture combined with herbal medicine；Mice

作者单位：1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院(上海 200433)，E-mail：happycatl@126.com；2.陕西中医学院附属医院

帕金森病(PD)是一种以黑质多巴胺能神经元(NDN)特征性缺失，广泛累及中枢神经系统、症候复杂多样的慢性神经元变性疾病。目前，关于PD的研究表明其与遗传因素、环境因素、兴奋性毒性与钙的细胞毒作用、线粒体功能障碍与氧化应激过度、免疫学异常、年龄老化、细胞凋亡、泛素蛋白酶体系统功能障碍、多聚 ADP核糖聚合酶过度活化等诸多因素有关，然根本发病机制尚未完全阐明[1]。L-dopa制剂目前仍被认为是治疗PD的金标准，可明显改善PD症状，但50%～80%的PD患者在服药后平均4.1年的时间里，出现了运动并发症[2]。多巴制剂除了在自身代谢过程中可引起诸多副反应外，有报道认为其代谢过程中产生的代谢产物本身就可诱发神经元凋亡[3，4]，从而破坏尚未受损的NDN及其通路，加速病程进展。因此，尽量推迟多巴制剂的应用，探索神经保护治疗方案已成为目前PD研究的新热点，可见现代医学对本病也缺乏根治的手段。

帕金森属中医学“颤证”“内风”等范畴，中医药在治疗本病中具有改善症状，延缓病程，提高生活质量，减少西药用量及其副反应，增强体质，提高抗病能力等优势。中药可轻度的抗僵直、抗震颤，调节黑质、纹状体中抗氧化应激的酶系统，增强抵抗自由基的能力，保护黑质神经元；针刺可调节脑内中枢通路的神经递质含量，尤其针刺后，可增加DA的含量。并且中医药特有的整体治疗特点，调整人体气血阴阳，使之趋于平衡，协调人体脏腑功能而改善症状。这种标本兼治的特点，西药难以具有，可弥补西药治疗的不足，和西药治疗有很大的互补性，可见挖掘中西医综合治疗PD很有必要。

本研究采用腹腔内注射MPTP制备PD小鼠模型，观察针药结合疗法对PD模型小鼠纹状体区多巴胺D1、D2受体活性的影响，而为临床研究提供进一步的实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物清洁级C57B L/6J雄性小鼠，8周龄，雄性，体重20 g±2 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物许可证号：SCXK(沪)2007-0005，置于室温18 ℃～21 ℃、相对湿度45%～55%、12 h昼夜周期的动物室内。7只/笼，自由进食、饮水。

1.1.2实验药品及主要仪器1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢毗睫(MPTP )，美国Sigma公司。抗小鼠D1、D2受体免疫组化试剂盒(上海麦莎生物科技有限公司)。中药：炙黄芪60 g，山萸肉60 g，天麻18 g，钩藤30 g，丹参30 g，羚羊角粉1.2 g。所有药材均购自上海中医药大学岳阳医院中药房。根据文献[5]方法制成4.16 g/mL益气养阴、熄风化瘀的PD方水煎液，0.1 mPa灭菌15 min，4℃保存备用。将美多巴批号SH0434，上海罗氏制药有限公司)。制备成相当于临床等效剂量10倍的水溶液0.002 5 g/mL，随配随用。华佗牌无菌针灸针(0.5寸毫针，直径0.25 mm，苏州医疗用品厂有限公司)，G6805-Ⅱ型电针治疗仪(上海医用电子仪器厂)。MIQAS医学图像定量分析系统、医学图像定量分析软件、BH2生物显微镜(日本OLYMPUS)、4500数码相机(NIKON)、HISTOSTAT-820切片机(RMC)，电子天平、漩涡混合器、高速离心机、超生匀浆机、超低温冰箱由岳阳医院中心实验室提供。

1.2方法

1.2.1制备PD模型小鼠C57BL/6J小鼠随机分为6组，每组14只，即正常组、模型组、中药组、西药组、中药结合针刺组。小鼠适应环境10 d后开始给药，其中模型组、西药组、中药组和在针药结合疗法组用生理盐水溶解MPTP后，30 mg/kg小鼠皮下注射，每日1次，连续7 d注射，制备PD小鼠模型；正常组皮下注射等量生理盐水，每日1次，连续7 d注射。

1.2.2治疗每组随机分为7 d组和14 d组(n=7)，每天09：00皮下注射MPTP，14：00治疗。7 d组和14 d组分别治疗7 d和14 d，分别于第8天和第15天上午处死取材。正常组：灌胃生理盐水0.1 mL/10 g；模型组：灌胃生理盐水0.1 mL/10 g。西药组：每天灌胃美多巴0.1 mL/10 g。中药组：中药胃管灌注PD方0.1 mL/10 g。中药PD方：羚羊角粉、山萸肉、钩藤、天麻、枸杞子、丹参等。针刺组：针刺穴取百会、运动前区(双侧)，哑门。针刺方法：毫针针刺后接G6805-2型电针仪，疏密波：疏波2 Hz，密波10 Hz ，电流强度1 mA电针刺激15 min，每日1次。针刺结合中药组：针刺穴取百会、运动前区(双侧)，针刺方法：毫针针刺后接G6805-2型电针仪，疏密波：疏波 2 Hz，密波10 Hz，电流强度1 mA，刺激15 min，每日1次。中药应用同中药组。7 d组针刺共7次，14 d组针刺共14次。

1.2.3自主活动计数检测参照Kawai等[5]测试方法，自制30 cm×30 cm×15 cm有机玻璃盒，底部刻出6 cm×6 cm的格子，在安静、光线较暗的环境中测试；小鼠适应环境10 min后，计算5 min内移动的格子数，连续测5次取平均值。分别在造模前1 d、造模后1 d、处死前1 d进行检测。

1.2.4样本采集与组织包埋切片各组小鼠于末次注射药物后次日断头，冰上剥脑，取左侧纹状体浸入含2.5%戊二醛固定液的安瓿中，固定 1 h；进行脱水；机器平板包埋，1 h～2 h后用MEDIS WEBER13/30RR型石蜡切片机切取(3～4)μm厚冠状平面的脑片。

1.2.5免疫组织化学(IHC)技术采用免疫组织化学二步染色法检测。

用MIQAS医学图像定量分析系统对脑片进行分析，测出阳性面积及光密度值(Optical Density)。通过OLYMPUS BH2生物显微镜25倍物镜下(10倍目镜)，全视场(351000像素点)测量，选用NIKON 4500数码相机对每张脑片摄片，每张选取3个视野，取平均值。计算出IHC指数。

2结果

2.1小鼠自主活动计数6组小鼠造模前自主活动计数无统计学意义(P>0.05)。正常组小鼠造模前、造模后、治疗后自主活动计数无统计学意义(P>0.05)；模型组小鼠造模后、治疗后自主活动计数显著低于造模前(P<0.01)，造模后、治疗后自主活动计数差异无统计学意义(P>0.05)；中、西药组小鼠造模后、治疗后自主活动计数显著低于造模前(P<0.01)，治疗后自主活动计数显著高于造模后(P<0.05)；针刺、针药组小鼠造模后、治疗后自主活动计数显著低于造模前(P<0.01)，治疗后自主活动计数显著高于造模后(P<0.05)。详见表1。

格/5rain

2.2针药结合疗法对帕金森病模型小鼠纹状体区多巴胺D1、D2受体活性的影响正常组小鼠纹状体区可见大量中等大小、呈圆形或椭圆形的免疫反应阳性神经元。模型组小鼠纹状体区的免疫反应阳性神经元数目明显减少(P<0.05)，治疗组纹状体区免疫反应阳性神经元数目均高于模型组，其中针药组及西药组有统计学意义(P<0.05)。

表2　干预 7 d后针药结合疗法对PD小鼠

表3　干预 14 d针药结合疗法对PD小鼠

3讨论

本实验运用针刺、中药、针药结合、西药分组治疗PD模型小鼠，观察其脑内多巴胺D1、D2受体活性变化。结果表明，MPTP造模后模型组、中药组、西药组、针刺、针药组小鼠出现了震颤、肢体强直、运动迟缓、步态不稳等症状，自主活动计数明显下降；经干预治疗后上述症状有所改善，自主活动计数有所上升，但低于正常状态。运用针刺与中药联合治疗PD模型小鼠比单用针刺，或单用中药治疗效果显著(P<0.05)，而单用针刺或单用中药治疗PD模型小鼠，效果并不显著(P>0.05)。西药治疗PD模型小鼠在各组数据比较中，仍具显著优势(P<0.05)。由于本实验时限限制，仅进行了7 d与14 d的数据比较，无统计学意义(P>0.05)。

帕金森病最主要的病理特征是含色素的神经元变性、缺失，尤以黑质致密部DA能神经元为主。多巴胺是一种抑制性神经介质，在黑质内合成的DA通过黑质纹状体束到达纹状体而发挥作用。当多巴胺能神经元减少60%～80%时，DA含量降至正常的30%，就会有PD的症状出现。在MPTP致PD的发病机制中涉及多种因素，其中多巴胺含量减少为MPTP致黑纹状体通路多巴胺能神经元死亡的根本原因。

随着人类社会的逐步老龄化，PD的发病率逐年增加，目前现代医学药物治疗只会使症状减轻，而不能有效延缓疾病进程。国内外开展的手术等治疗PD的方法仍处于探索阶段。中医药治疗PD在减轻疾病症状、延缓疾病的进程、避免现代医学药物长期治疗后的不良反应方面可能起到重要作用。

近年来，在中医药治疗PD机制方面进行的大量研究和探讨，发现中医药通过保护黑质细胞、提高神经递质含量、抑制氧化应激反应、低兴奋性毒性作用等作用机制，可以显著改善PD。运用中药制剂对DA活性影响的研究也是主要热点。蔡定芳[5]研究表明，养肝熄风方能够调节多巴胺合成的限速酶酪氨酸羟化酶；王亚丽等[6]观察到活血止颤口服液能提高鼠脑内DA含量；鲍远程等[7]认为抗震止痉胶囊能提高纹状体DA含量及VA/HVA比值，其机制可能在于减轻自由基损害，减少DA分解代谢。陈建宗等[8]发现枸杞子、肉苁蓉、何首乌等组成的培补肝肾中药可以提高 PD大鼠脑部纹状体DA、3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、NE、5-HT等含量，且对黑质、蓝斑、中缝背核等神经核团有一定保护作用。

针灸作为现代替代医学中的重要力量，已得到了世界多数国家的认可及合法的医疗地位。针灸在治疗PD中疗效也已得到肯定，其疗效主要体现在改善症状、延缓病程、减少西药用量及其副反应等方面，这种治疗方法被越来越多的患者所接受。动物实验表明，针刺能明显减轻PD模型大鼠中脑黑质多巴胺能神经元的凋亡[9]，改善大鼠行为学，提高纹状体DA及其代谢产物的含量。王玲玲等[10]观察针灸对 PD 患者脑干诱发电位Ⅴ波潜伏期、Ⅲ-Ⅴ峰间期和Ⅰ-Ⅴ峰间期三项指标的影响，结果针灸组Ⅴ波潜伏期、Ⅲ-Ⅴ峰间期及Ⅰ-Ⅴ峰间期均见明显缩短，这种缩短与 Webster量表的减少呈现明显的相关关系，针灸可能提高了脑内DA的含量及脑内 DA能神经元的兴奋性，获得了临床疗效。罗明富等[11]用免疫荧光法观察电针阳陵泉和舞蹈震颤区对 PD大鼠中脑黑质和肾上腺髓质酪氨酸羟化酶 (TH )的影响，发现病侧电针组的荧光反应强于对照组，提示电针可能增强了TH的活性。针刺可以调节脑内中枢通路的神经递质含量，针刺后DA含量增加，针刺能够通过刺激神经通路，促使神经递质DA的分泌合成，使PD的症状得以缓解。

本实验中应用针药结合干预治疗PD模型小鼠，观察其脑内多巴胺D1、D2受体活性，显示针药连用治疗显著优于单用针刺或单用中药治疗，为今后临床帕金森患者提供了一种新的治疗参考模式。

参考文献：

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[5]蔡定芳，陈锡群，高颖，等.补肾养肝方药对长期服用左旋多巴帕金森病大鼠黑质纹状体功能的影响[J].中国中西医结合杂志 ，2002，22(1)：43-46.

[6]王亚丽.颤证病理机制及治疗的实验研究[J].陕西中医学院学报，1999，22(6)：45-46.

[7]鲍远程，朱红艳.抗震止痉胶囊对帕金森大鼠氨基酸类神经递质含量的影响[J].中国医师杂志，2004，增刊：68-70.

[8]陈建宗 ，李刚 ，谢永宏 ，等.培补肝肾中药对 PD小鼠模型纹状体某些单胺类递质的影响[J].成都中医药大学学报，2002，(25)4 ：34.

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[10]王玲玲 ，何崇 ，刘跃光 ，等.针刺对 PD 患者脑干诱发电位的影响[J].南京中医药大学学报(自然科学版)，2000，16(4)：229.

[11]罗明富，王志英，王平.电针对震颤麻痹大鼠脑部和肾上腺髓质酪氨酸羟化酶的影响[J].针刺研究，1997，22(4)：292.

(本文编辑王雅洁)