舒芬太尼后处理对糖尿病和非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其与PI3K/Akt通路的关系

秦咏咏，王建刚，田首元，曾丽红，任强

摘要：目的探讨舒芬太尼后处理对糖尿病和非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其与磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶(PI3K/Akt)通路的关系。方法健康雄性SD大鼠，体重160 g～180 g，采用腹腔注射链脲佐菌素35 mg/kg的方法制备糖尿病模型，取造模成功的大鼠24只，饲养2周后，采用随机数字表法，将其随机分为4组(每组6只)：糖尿病假手术组(DM-S组)、糖尿病缺血再灌注组(DM-I/R组)、糖尿病舒芬太尼后处理组(DM-SP组)和糖尿病舒芬太尼后处理+Wortmannin组(DM-SP+W组)。另取健康的正常SD大鼠24只，体重250 g～300 g，采用随机数字表法，将其随机分为4组(每组6只)：非糖尿病假手术组(NDM-S组)、非糖尿病缺血再灌注组(NDM-I/R组)、非糖尿病舒芬太尼后处理组(NDM-SP组)和非糖尿病舒芬太尼后处理+Wortmannin组(NDM-SP+W组)。采用结扎左冠状动脉前降支30 min，再灌注120 min的方法制备心肌缺血再灌注模型。S组只穿线不结扎，SP组和SP+W组于再灌注前5 min经舌下静脉注射舒芬太尼1.0 μg/kg，SP+W组在注射舒芬太尼前注射PI3K抑制剂Wortmannin15 μg/kg。再灌注120 min时取血样，测定乳酸脱氢酶(LDH)的活性；处死大鼠后，取心脏，采用TUNEL法测心肌细胞凋亡指数(AI)；另取心脏，测心肌梗死范围；采用Western blot法检测心肌组织Akt、p-Akt的表达水平。结果与S组比较，糖尿病和非糖尿病大鼠的IR组、SP组和SP+W组LDH活性升高、AI增加、心肌梗死范围增大、p-Akt/Akt的比值略增大(P<0.05)；与I/R组比较，非糖尿病大鼠SP组LDH活性降低、AI减少、心肌梗死范围减小、p-Akt/Akt的比值增加(P<0.05)，SP+W组上述指标差异无统计学意义；与I/R组比较，糖尿病大鼠SP组和SP+W组上述指标差异无统计学意义。结论舒芬太尼后处理可通过激活PI3K/Akt通路减轻非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤，而糖尿病因素可消除舒芬太尼后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

关键词：糖尿病；舒芬太尼；后处理；磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶；心肌再灌注损伤

中图分类号：R587R285

通讯作者：王建刚，E-mail：wjg80_2008@163.com

收稿日期：(2014-09-12)

The Role of Sufentanil Postconditioning in Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Diabetic and Non-diabetic Rats and with the PI3K-AKT Signal Pathway

Qin Yongyong，Wang Jiangang，Tian Shouyuan，Zeng Lihong，Ren Qiang

First Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

Corresponding Author：Wang Jiangang

Abstract：ObjectiveTo investigate the role of sufentanil postconditioning in myocardial ischemia-reperfusion injury in diabetic and non-diabetic rats and retation with the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-AKT signal pathway.MethodsHealthy male Sprague Dawley (SD) rats weighing 160-180 g were used in this study.Diabetes mellitus was established by intraperitoneal streptozotocin 35 mg/kg and was confirmed by blood glucose≥16.7 mmol/L.Two weeks after diabetes mellitus was induced，24 rats were randomly divided into 4 groups(n=6 each)：diabetic mellitus sham operation group(group DM-S)，diabetic mellitus ischemia-reperfusion group(group DM-IR)，diabetic mellitus sufentanil postconditioning group (group DM-SP)and diabetic mellitus sufentanil postconditioning+Wortmannin group(group DM-SP+W).Another 30 nondiabetic mellitus rats were also randomly divided into 4 group ( n=6 each)：nondiabetic mellitus sham operation group (group NDM-S)，nondiabetic mellitus ischemia-reperfusion group(group NDM-IR)，nondiabetic mellitus sufentanil postconditioning group (group NDM-SP)and nondiabetic mellitus sufentanil postconditioning+Wortmannin group(group NDM-SP+W).Myocardial ischemia-reperfusion was induced by 30 min occlusion of left anterior descending branch of coronary artery followed by 120 min reperfusion.Group S was not helgated.Sufentanil postconditioning was induced by injection of sufentanil 3.0 μg/kg at 5 min before reperfusion.Group SP+W was induced by injection of Wortmannin(P13K inhibitor)15ug/kg before sufentanil.Arterial blood samples were collected at 120 min of reperfusion for measurement of plasma lactate dehydrogenase(LDH)activities and measurement apoptosis index(AI) and myocardial infarction rang was calculated .The expression of Akt and phosphorylated Akt(p-Akt)was determined by Western blotting.ResultsCompared with group S，LDH activities and cardiomyocyte apoptosis and myocardial infarction rang increased，and p-Akt/Akt up-regulated during myocardial ischemia reperfusion in group IR and group SP and group SP+W of diabetic and nondiabetic rats(P<0.05).Compared with group IR，LDH activities and cardiomyocyte apoptosis and myocardial infarction rang decreased and p-Akt/Akt up-regulated in nondiabetic rats(P<0.05). Conciusion Sufentanil postconditioning may attenuate cardiomyocyte apoptosis by IR injury in nondiabetic rat hearts through activating PI3K/Akt.Diabetes mellitus factor can negate sufentanil postconditioning induced protection against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.

Key words：diabetes mellitus；sufentanil；postconditioning；1-phosphatidlylinositol 3-kinase/protein-serine-threonine kinase；myocardial ischemia-reperfusion injury

糖尿病严重威胁人类健康，是心血管疾病患者并发心肌梗死的独立危险因素[1]，减轻糖尿病患者的心肌缺血再灌注损伤在临床上很重要。本实验前期研究表明[2-4]，舒芬太尼后处理可以减轻非糖尿病大鼠心肌的缺血再灌注损伤，减少心肌细胞凋亡，机制可能与PI3K1AKT信号通路有关。但舒芬太尼后处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用，目前研究尚罕见。本实验拟研究舒芬太尼后处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制。

作者单位：山西医科大学第一医院(太原 030001)

1材料与方法

1.1实验动物健康雄性SD大鼠，体重140 g～160 g，山西医科大学动物实验中心提供。

1.2造模方法参照文献[4]提供的方法制备糖尿病模型。高糖高脂喂养4周后，腹腔注射链脲佐菌素(批号：905B0314，Solarbio公司)35 mg/kg，注射72 h后测空腹血糖≥16.7 mmol/L，并有多饮多食多尿视为模型制备成功，成模后继续高糖高脂喂养2周实验。

1.3实验分组取造模成功的糖尿病大鼠24只，采用随机数字表法，将其随机分为4组(n=6)：糖尿病假手术组(DM-S组)、糖尿病缺血再灌注组(DM-I/R组)、糖尿病舒芬太尼后处理组(DM-SP组)和糖尿病舒芬太尼后处理+Wortmannin组(DM-SP+W组)。另取健康正常SD大鼠24只，采用随机数字表法，将其随机分为4组(每组6)：非糖尿病假手术组(NDM-S组)、非糖尿病缺血再灌注组(NDM-I/R组)、非糖尿病舒芬太尼后处理组(NDM-SP组)和非糖尿病舒芬太尼后处理+Wortmannin组(NDM-SP+W组)。

腹腔注射20%的乌拉坦5 ml/kg麻醉后。针状电极插入左前肢、右前肢和右后肢皮下，连续监测Ⅱ导联心电图。颈部正中切开气管，插管后连接HX-300动物呼吸机行机械通气，吸入氧浓度40%，调节呼吸频率或潮气量，维持pH值7.35～7.45、血二氧化碳分压(PaCO2)(30～40)mm Hg(1 mmHg=0.133 kPa)、PaO2(90～150)mm Hg。于左侧胸壁第3、4肋间距离胸骨左缘0.5 cm处开胸，暴露心脏，在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉主干处用7-0缝线结扎左冠状动脉前降支，缝线末端穿入自制圈套管，平衡10 min，制备心肌缺血再灌注模型。以结扎左冠状动脉前降支后，心电图Ⅱ导联ST段抬高0.1 mV或T波高耸，心肌颜色变暗红色为结扎成功的标志；结扎30 min后松开结扎线，再灌注120 min，以缺血区心肌变红，抬高的ST段或T波回落为再灌注成功的标志。S组只穿线不结扎左冠状动脉前降支；SP组和SP+W组于再灌注前5 min经舌下静脉注射舒芬太尼(批号：1130902，宜昌人福医药有限责任公司)1.0 μg/kg，SP+W组在注射舒芬太尼前注射PI3K抑制剂渥曼青霉素Wortmannin(批号：LG10O14，北京百灵威科技有限公司)15 μg/kg[5]。实验期间维持大鼠直肠温36.5 ℃～37.5 ℃。

1.4血生化指标测定再灌注120 min时，取腹主动脉血样2 mL，4℃3 500 r/min离心15 min，取上清液，用大鼠LDH检测试剂盒(酶标仪法，南京建成生物工程研究所)检测活性。

1.5心肌凋亡指数测定再灌注120 min时，取心尖组织，4%甲醛固定4 h以上，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)说明书进行操作。每张切片光镜(400倍)下随机选取5个高倍视野，计算凋亡指数(AI)，取5个视野的平均值。

1.6心肌梗死范围测量将心肌从结扎线下切成5份，用0.125% NBT常温染色15 min，非梗死区被染成蓝色，梗死区呈灰白色。将梗死区心肌剪下，称重，以梗死区心肌湿重占全心肌湿重的百分比表示心肌梗死的范围。

1.7心肌Akt、p-Akt蛋白表达测定用BCA法进行蛋白定量。根据蛋白定量结果加入总蛋白样品和上样缓冲液，用电转仪将凝胶上分离到的蛋白转移到PVDF膜上，5%BCA封闭2 h，用兔抗鼠Akt和p-Akt单克隆抗体(稀释度1∶10 000，ABCAM公司，美国)4℃孵育过夜，次日用HRP标记的羊抗兔二抗(稀释度1∶5000，武汉博士德生物工程有限公司)孵育2 h，ECL发光液显影。采用凝胶成像系统进行分析，以目的蛋白条带灰度值和GAPDH条带灰度值的比值反映Akt和p-Akt的表达。

2结果

非糖尿病大鼠饮食、进水和尿量均正常，毛色白且有光泽；糖尿病大鼠饮食、进水和尿量均明显增加，毛色发黄且易脱落。与NDM-S组比较，NDM-I/R组、NDM-SP组和NDM-SP+W组血浆LDH活性升高、AI增加、心肌梗死范围增大、p-Akt/Akt的比值略增大(P<0.05)；与NDM-I/R组比较，NDM-SP组血浆LDH活性降低、AI减少、心肌梗死范围减小、p-Akt/Akt的比值增加(P<0.05)；NDM-SP+W组上述各指标差异无统计学意义(P>0.05)；与DM-S组比较，DM-I/R组、DM-SP组和DM-SP+W组血浆LDH活性升高、AI增加、心肌梗死范围增大、p-Akt/Akt的比值略增大(P<0.05)；与DM-I/R组比较，DM-SP组和DM-SP+W组上述各指标差异无统计学意义；与NDM-SP组比较，DM-SP组血浆LDH活性、CK-MB浓度均升高(P<0.05)。详见表1、表2。

表1　各组大鼠LDH、AI和心肌梗死范围的比较( ±s)

表2　各组大鼠Akt、p-Akt和p-Akt/Akt的比较( ±s)

3讨论

本研究采用高糖高脂饮食诱导大鼠胰岛素抵抗，联合腹腔链脲佐菌素(35 mg/kg)选择性破坏部分胰岛β细胞的方法建立糖尿病大鼠模型[4]。建模后大鼠血糖≥16.7 mmol/L，提示糖尿病模型制备成功；糖尿病并发心血管疾病与病程有关，因此本研究采用糖尿病模型制备成功后2周。

采用结扎左冠状动脉前降支30 min，恢复灌注120 min的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型[5]；并参照文献[2]及预实验结果确定舒芬太尼后处理给药时机和剂量。本研究结果表明，与S组相比，非糖尿病和糖尿病大鼠再灌注120 min时IR组LDH活性和心肌细胞凋亡指数增加，表明大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型制备成功。而舒芬太尼后处理可明显减轻非糖尿病大鼠心肌细胞凋亡和心肌梗死范围，糖尿病大鼠的上述指标没有减轻，表明舒芬太尼后处理对非糖尿病大鼠具有心肌保护作用，而对糖尿病大鼠没有保护作用。Wortmannin的给药时间及剂量均参照文献[6]。

本研究结果表明，PI3K抑制剂Wortmannin可拮抗非糖尿病大鼠舒芬太尼后处理的心肌保护作用，提示舒芬太尼后处理可能通过激活PI3K/Akt通路抑制非糖尿病大鼠心肌细胞凋亡发挥心肌保护作用。PI3K可磷酸化肌醇环上的3位羟基，生成三磷酸磷脂酰肌醇，其可磷酸化激活Akt生成p-Akt，p-Akt，进一步磷酸化调控下游靶标如糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和凋亡蛋白等，参与细胞的分化和凋亡[7]。舒芬太尼后处理激活PI3K/Akt通路的具体机制尚有待进一步研究。

糖尿病大鼠给予舒芬太尼后处理，血浆LDH活性、AI和心肌梗死范围未降低，p-Akt/Akt的比值也未改变，提示舒芬太尼后处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤没有保护作用，PI3K-Akt通路不参与此过程。

Yadav等[8]研究表明，糖尿病因素可通过影响GSK-3β的磷酸化水平抑制缺血预处理的心肌保护作用。因此推断糖尿病因素可能通过影响GSK-3β的磷酸化水平阻碍舒芬太尼心肌保护作用，有待进一步研究。

舒芬太尼后处理可通过激活PI3K/Akt通路减轻非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤，而糖尿病因素可消除舒芬太尼后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

参考文献：

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(本文编辑王雅洁)