内皮祖细胞与脑动脉粥样硬化的相关性研究

黄志新1，2，蔡晋1，朱武生1，马敏敏1

摘要：目的探讨内皮功能紊乱的标志物(内皮祖细胞)与脑动脉粥样硬化的相关性。 方法对131例患者采用流式细胞术检测外周血内皮祖细胞数量及(DSA)评估颅内外脑动脉粥样硬化程度。记录人口统计学资料和血管危险因素，并进行比较分析。结果控制混杂因素后，与对照组相比发生脑动脉粥样硬化组的内皮祖细胞水平显著降低(OR=0.344； 95%CI，0.150～0.792；P=0.012)，其次，多元Logistic回归分析显示，内皮祖细胞计数与脑动脉粥样硬化的部位呈负相关。颅内动脉粥样硬化与内皮祖细胞计数无统计学意义(P> 0.05)。结论内皮祖细胞是脑动脉粥样硬化的较好独立预测因素，内皮祖细胞数量降低与脑动脉粥样硬化存在潜在的病理生理联系。

关键词：内皮祖细胞；脑动脉粥样硬化；内皮功能紊乱

中图分类号：R743R255

基金项目：国家自然基金资助项目(No.81400332、81171099)

通讯作者：马敏敏，E-mail：xfliu2@vip.163.com

收稿日期：(2015-04-09)

Huang Zhixin，Cai Jin，Zhu Wusheng，Ma Minmin

Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，PLA，Nanjing 210002，Jiangsu，China；Shenzhen Nanshan People's Hospital，Guangdong Medical College，Shenzhen 518052，Guangdong，China

Corresponding Author：Ma Minmin(Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，PLA，Nanjing 210002，Jiangsu，China)

Abstract：ObjectiveWe therefore to investigated the relationship between the level of EPCs and the severity of CAD.MethodsEPCs were measured by flow cytometry.Digital subtraction angiography (DSA) was performed on 197 patients to assess intracranial and extracranial cerebral atherosclerosis.The individuals’demographic data，biochemical variables and vascular risk factors were collected in detail，compared and analyzed.ResultsThere was a significant negative correlation between EPCs level and the prevalence of CAD after controlling for confounders (odds ratio，OR=0.344； 95%CI(confidence interval):0.150 to 0.792；P=0.012).Next，multivariate logistic regression showed that only EPCs count was significantly negatively associated with the location of CAD.However，EPCs were not significantly associated with intracranial atherosclerosis (P>0.05). Conciusion EPCs were the strong and independent predictor of the progression of cerebral atherosclerosis even after controlling for traditional risk factors.Therefore，increased EPCs might contribute to delay or prevent the occurrence and development of cerebral atherosclerosis.

Key words：cerebrovascular atherosclerosis；endothelial progenitor cells；endothelial dysfunction

卒中是成人致残致死的主要原因，其中缺血性卒中占87%[1]。脑动脉粥样硬化(CAD)是本病发生发展的主要原因，在动脉粥样硬化的基础上，血管管腔狭窄、闭塞或血栓栓塞，即可引发相应神经功能缺损的症状和体征[2]。而内皮功能紊乱在脑动脉粥样硬化发生中又起着决定性作用[3]。内皮祖细胞(EPCs)在内皮损伤后修复中起决定性作用，是一种新型的内源性血管修复机制[4]。当内皮损伤后，EPCs可以归巢到损伤部位，分泌内皮细胞生长因子及分化为内皮细胞替代损伤的内皮细胞，起保护血管内皮抗动脉粥样硬化作用[5]。循环内皮祖细胞的数量降低提示内皮功能障碍，与不同程度的心血管危险因素密切相关，如吸烟、糖尿病、高血脂和高血压[6-8]。Werner等[9，10]发现内皮祖细胞与一些动脉粥样硬化性血管疾病如冠心病、外周血管闭塞性疾病的严重程度呈负相关。然而，脑动脉粥样硬化负荷和内皮祖细胞水平的严重程度之间的关系鲜见报道。本研究旨在探讨CAD严重程度与内皮祖细胞数量的关系。进一步评估内皮祖细胞与传统心血管危险因素(年龄、性别、吸烟、高脂血症、高血压等)相关性，以及对CAD严重程度预测是否优于传统的危险因素。

通过VISSIM仿真软件分析研究了深南大道主辅路交通组织模式的准入条件和设置标准，从仿真中得到不同进口道饱和度下主辅路汇入点距离停车线位置与车均延误变化的关系，见表3.

作者单位：1.南京军区总医院(江苏 南京210002)；2.广东医学院附属深圳南山医院

1资料与方法

1.1研究对象选择2011年12月—2012年12月在我院神经内科住院行脑血管造影或支架治疗的患者131例作为研究对象。神经功能缺失程度由两位不知患者临床资料及造影结果的神经内科医师采用美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)进行评估。入组标准：有头晕、头痛及偏瘫等脑缺血症状患者；有行数字减影血管造影的适应证；在脑卒中后早期内皮祖细胞的数量增加，1个月后回到基线水平[11]，选择缺血性卒中发病后1个月者。排除标准：肾脏或肝脏疾病，房颤，二尖瓣狭窄，心室壁瘤，心肌梗死，恶性肿瘤，纤维肌性发育不良，血管畸形，动脉瘤，炎性疾病，出血性中风和脑手术；既往有冠状动脉介入治疗或冠状动脉旁路移植手术史；有症状的外周动脉疾病者；既往有颈动脉内膜切除术或颈动脉支架置入术史患者。该研究经院伦理委员会讨论通过，且患者或家人签署知情同意书。

1.2流式细胞仪检测外周血EPCs数量在DSA检查前，收集外周血样本(5 mL)置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中并立即送往中心实验室。用荧光标记的抗人单克隆抗体对血标本进行染色标记，分别加入CD45-FITC、CD309(VEGFR-2/KDR)-Alexa Fluor®647、CD34-perCP-efluor®710。血液样本(200 μL)在室温下与抗体孵育30 min。用相应的同型对照抗体作为阴性对照。孵育后，每个样品加入2.5 mL 1×裂解缓冲液(BD Biosciences)孵育10 min。然后将样品用FACS缓冲液洗两次。流式细胞仪收集106事件数，进一步flowjo软件分析。内皮祖细胞定义为CD45弱表达且CD133、CD309双阳性的细胞群[12]，所有数据由一位不知临床资料的流式细胞检测专家分析。

1.3血管评估入组患者股动脉穿刺行DSA检查，按照血管病变部位分为颅内、颅外及混合病变。颅内病变定义为颈内动脉为岩骨段以上，而椎动脉定义为进入枕骨大孔穿硬脑膜处。颅内外动脉病变分别采用既往研究所行的测量方法，以狭窄程度 ≥ 50%定为狭窄病变。以上评分由两位不知临床治疗的神经影像科医师共同协商并达成一致意见来评估。

2结果

2.1一般资料该项研究共入组131例，平均年龄61岁，女性34例(26.0%)，男性97例(74.0%)。单纯颅内病变患者40例(30.5%)，。脑动脉硬化组75例，单纯颅外病变35例(26.7%)。无明显脑动脉粥样硬化狭窄的56例作为对照组。CD34+CD309+、CD133+CD309+及CD34+CD133+CD309+细胞的中位数分别为0.117%(0.046%～0.295%)、0.089%(0.027%～0.218%)及0.013%(四分位间距为0.004%～0.049%)。

2.2动脉粥样硬化组与对照组单变量分析EPCs及抗血小板药物应用有统计学意义。详见表1。单变量分析P小于0.2的变量纳入二元Logistic回归分析，校正了混杂因素如高血压、性别、抗凝血药物、抗高血压药物及空腹血糖后，脑动脉粥样硬化仍与EPCs负相关，即脑动脉粥样硬化组EPCs的数量明显降低：[OR=0.344，95% CI：0.150～0.792，P=0.012]。ROC曲线下面积为0.738，面积的标准误为0.088，用于判断脑动脉粥样硬化性狭窄有统计学意义(P=0.025)。

表1　脑动脉粥样硬化组与对照组临床指标比较

2.2多因素Logistic回归分析对动脉粥样硬化的危险因素进行预测，潜在的预测因素仍采用单因素分析P<0.20的纳入方程。多因素非条件Logistic回归分析结果表明，内皮祖细胞计数显著与CAD的位置呈负相关。内皮祖细胞与颅内动脉粥样硬化无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2　EPCs与脑动脉粥样硬化的相关性

3讨论

该研究发现单纯颅外动脉狭窄(26.7%)的患者较颅内动脉狭窄(30.5%)少。这与以往的研究结果相一致，既往研究发现颅内动脉粥样硬化多见美国西班牙裔、黑人，中国和日本人，而白种人以颅外动脉粥样硬化多见[13，14]。遗传研究和大量的流行病学研究证实，遗传因素和环境因素在动脉粥样硬化的血管分布起着重要的作用[15]。重要发现在于校正了混杂因素如高血压、性别、抗凝血药物、抗高血压药物及空腹血糖后，CAD患者EPCs数量明显减少，数据表明即使在控制了传统的心血管危险因素后，EPCs仍然是脑动脉粥样硬化的独立预测因素。或许低EPCs可能是因其他传统心血管危险因素的存在所致。毕竟以往研究已经报道EPCs数量和心血管危险因素之间呈负相关。在控制了高血压等混杂因素后，EPCs与CAD仍有显著相关性，脑血管疾病个体易感性可能不仅取决于传统危险因素，内皮损伤的修复能力也起着一定作用[16]。内皮祖细胞是成人骨髓来源的多能成体祖细胞，是一个新的内源性血管修复系统，在血管内皮损伤修复中起着决定性的作用[17]。

传统观念认为动脉粥样硬化是血管内皮对于血流剪应力及损伤所发生的一种病理血管反应。然而最近的一些观点认为是由于血管内皮损伤与修复的动态平衡破坏所致，当循环中的EPCs数量减少可能导致损伤的内皮得不到及时的修复，那么动脉粥样硬化就随之而来了[16]。EPCs将来有望成为内皮功能紊乱的有潜力的治疗方法之一。进一步多因素Logistic回归分析显示，仅内皮祖细胞数量减少与颅外或颅内外联合病变相关，而颅内动脉狭窄患者EPCs数量下降不明显。但是单纯以传统的危险因素或遗传因素均不能解释该差异产生的原因。或许因颅内外血管动脉粥样硬化的机制不同，颅内病变内可能并不是以内皮细胞损伤为主，粥样斑块破裂发生在颅内血管的也较轻微，导致内皮祖细胞的动员较颅外病变为少[18，19]。或许因颅内外血管动脉粥样硬化的机制不同，颅内病变内可能并不是以内皮细胞损伤为主，粥样斑块破裂发生在颅内血管的也较轻微，导致内皮祖细胞的动员较颅外病变为少。纤维蛋白原参与血栓形成及提高血液黏度，是心血管疾病尤其是冠状动脉心脏病的促发因素[20，21]。本研究结果表明，升高血浆纤维蛋白原可增加脑动脉粥样硬化的风险。该研究存在一定的不足、首先，非多中心研究，患者主要来自中国东南部。其次，本研究的样本量相对较小。该研究为初步探索性研究。

内皮祖细胞在缺血性脑血管中维持内皮完整性或抗内皮损伤中起着一定的作用。循环内皮祖细胞减低可以视为CAD(尤其是颅外动脉粥样硬化)的预测指标之一和反映当前血管内源性修复能力。是否EPCs可作为CAD进展的动态观测指标有待于进一步的探索。

参考文献：

[1]Lloyd-Jones D，Adams R，Carnethon M，et al.Heart disease and stroke statistics 2009 update：A report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee[J].Circulation，2009，119(3)：480-486.

[2]Kim J，Song TJ，Song D，et al.Nonrelevant cerebral atherosclerosis is a strong prognostic factor in acute cerebral infarction[J].Stroke，2013，44(7)：2013-2015.

[3]Marti-Fabregas J，Delgado-Mederos R，Crespo J，et al.Circulating endothelial progenitor cells and the risk of vascular events after ischemic stroke[J].PLoS One，2015，10(4)：e124895.

[4]Deanfield JE，Halcox JP，Rabelink TJ.Endothelial function and dysfunction：Testing and clinical relevance[J].Circulation，2007，115(10)：1285-1295.

[5]Psaltis PJ，Simari RD.Vascular wall progenitor cells in health and disease[J].Circ Res，2015，116(8)：1392-1412.

[6]Hill JM，Zalos G，Halcox JP，et al.Circulating endothelial progenitor cells，vascular function，and cardiovascular risk[J].N Engl J Med，2003，348(7)：593-600.

[7]陈蓉蓉，姜亚军.血管内皮祖细胞功能的影响因素[J].中西医结合心脑血管病杂志，2011，9(12)：1503-1504.

[8]Antonio N，Fernandes R，Soares A，et al.Reduced levels of circulating endothelial progenitor cells in acute myocardial infarction patients with diabetes or pre-diabetes：Accompanying the glycemic continuum[J].Cardiovasc Diabetol，2014，13：101.

[9]Werner N，Kosiol S，Schiegl T，et al.Circulating endothelial progenitor cells and cardiovascular outcomes[J].N Engl J Med，2005，353(10)：999-1007.

[10]Yu P，Li Q，Liu Y，et al.Pro-angiogenic efficacy of transplanting endothelial progenitor cells for treating hindlimb ischemia in hyperglycemic rabbits[J].J Diabetes Complications，2015，29(1)：13-19.

[11]Bogoslovsky T，Chaudhry A，Latour L，et al.Endothelial progenitor cells correlate with lesion volume and growth in acute stroke[J].Neurology，2010，75(23)：2059-2062.

[12]Matusiak L，Batycka-Baran A，Bieniek A，et al.Decreased number of circulating endothelial progenitor cells in hidradenitis suppurativa patients[J].Dermatology，2015，230(3)：228-233.

[13]Zhang S，Zhou Y，Zhang Y，et al.Prevalence and risk factors of asymptomatic intracranial arterial stenosis in a community-based population of Chinese adults[J].Eur J Neurol，2013，20(11)：1479-1485.

[14]White MJ.Genes count：Attenuated cerebral vasodilator capacity in young African Americans[J].Exp Physiol，2015，100(1)：1.

[15]Takeya Y，Popper JS，Shimizu Y，et al.Epidemiologic studies of coronary heart disease and stroke in Japanese men living in Japan，Hawaii and California：Incidence of stroke in Japan and Hawaii[J].Stroke，1984，15(1)：15-23.

[16]Goldschmidt-Clermont PJ，Peterson ED.On the memory of a chronic illness[J].Sci Aging Knowledge Environ，2003，2003(45)：e8.

[17]Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science，1997，275(5302)：964-967.

[18]Timsit SG，Sacco RL，Mohr JP，et al.Early clinical differentiation of cerebral infarction from severe atherosclerotic stenosis and cardioembolism[J].Stroke，1992，23(4)：486-491.

[19]Sidhu PS，Naoumova RP，Maher VM，et al.The extracranial carotid artery in familial hypercholesterolaemia：Relationship of intimal-medial thickness and plaque morphology with plasma lipids and coronary heart disease[J].J Cardiovasc Risk，1996，3(1)：61-67.

[20]Pieters，Kotze RC，Jerling JC，et al.Evidence that fibrinogen gamma regulates plasma clot structure and lysis relationship to cardiovascular risk factors in black Africans[J].Blood，2013，121(16)：3254-3260.

[21]Chapin JC，Hajjar KA.Fibrinolysis and the control of blood coagulation[J].Blood Rev，2015，29(1)：17-24.

(本文编辑王雅洁)